脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离
一、实验目的
1.熟悉细胞分离的基本原理
2.掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法
3.掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法
二、实验原理
1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料
小鼠
手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板
平皿，尼龙膜指套、研磨棒、
吸管、试管、EP管、移液器和tips
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板
0.2%台盼蓝染液
8.显微镜
四、实验步骤
（一）取小鼠脾脏
1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：
1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使
单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲
洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬
液。(放置冰上)
4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）
5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度
a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数；
3.细胞计数：细胞浓度（个/mL)=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）
×104×稀释倍数。
每个脾脏的总细胞数：细胞浓度（个/mL) ×10mL
注：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细胞无反光，则为死细胞；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个细胞中活细胞的百分率，一般活力应在95%以上。
注意事项：
1.通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
2.在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他细胞。
五、实验数据处理和分析
从EP管中取出悬好的单个核细胞10μl后，加入40μlPBS，再加入50μl台盼蓝染料，然后吸取一滴于细胞计数板上，此时稀释倍数为10倍，然后于镜下计数得4个大方格的活细胞+死细胞个数为——
293+1、305+5、309+3、353+3
计算得本次取出的单个核细胞浓度为3.15*107个/ml。
活细胞百分率为：99.06%。
由于后面流式所需脾脏细胞个数为1x106-5x106，所以本小组吸取了已提取细胞液160μl，约5x106个细胞进行离心，用以流式分选。
六、经验总结与思考
个人认为在处死小鼠时新手不熟练使用颈椎脱位法太过于残忍，有很多同学把尾巴扯断，希望老师以后教学时能换一种处死方式如腹腔注射等。
由于脾脏紧靠肋弓，所以取脾脏时侧卧位要比直接开腹腔更方便寻找脾脏，也不容易导致失手将脾脏剪断的现象发生。
在血红细胞表面上有红细胞专属的表面抗原,当裂解液中含可以攻击特定红细胞表面抗原的酶的时候只会造成红细胞的变形,生物通道扩大,膨胀,裂解,或者引起红细胞的变性，而不会攻击其他细胞。另外红细胞有自己的电负性,渗透脆性(通常是一些非酶细胞裂解液的突破点) ,悬浮稳定性,红细胞裂解液就是利用这些特性裂解红细胞。本次实验中第一次裂解离心后发现细胞沉底中仍有红细胞存在，因此又重复裂解了一次，直到沉淀红色不明显才停止。经过思考我认为短时多次的重复要优于少次长时的裂解，因为红细胞裂解液不能完全保证不损伤白细胞，所以太长时间的裂解也会影响提取所得白细胞的数量。
淋巴细胞分离液说明书
Lonza Walkersville, Inc. https://www.360docs.net/doc/6213299566.html, biotechserv@https://www.360docs.net/doc/6213299566.html, Tech Service: 800-521-0390 Document # INST-17-829-1 06/07 Walkersville, MD 21793-0127 USA ? 2007 Lonza Walkersville, Inc. Lymphocyte Separation Medium Instruction For Use 17-829E Introduction Lymphocyte Separation Medium (LSM) is a mixture of Ficoll? and sodium diatrizoate (Hypaque) with density adjusted to 1.077 g/ml. This sterile filtered product is intended for laboratory/manufacturing use, and is not for in vitro diagnostic use. It is commonly used to isolate lymphocytes from human blood. One protocol to accomplish this is presented here. Protocol 1. Anticoagulated blood (citrated or heparinized) should be used. Note: Always treat human and other primate source material as potentially infectious and take safety precautions. 2. Dilute blood 1:1 with calcium-magnesium-free PBS and layer 9 ml onto 6 ml LSM. Use a clear plastic centrifuge tube with a cap. For large volumes use a similar ratio of diluted blood to LSM. 3. Centrifuge at 400xg for 15 minutes. 4. Remove plasma-PBS without disturbing the interface. 5. Collect the interface with a cannula and dilute to 20 ml in serum-free medium, such as RPMI 1640. 6. Centrifuge at 70xg for 10 minutes. 7. Discard supernatant fluid and resuspend pellet in 2-3 ml serum-free medium. 8. Count nucleated cells on a hemocytometer or electronic counting device. 9. Lymphocytes will be concentrated at the interface, along with some platelets and monocytes. Granulocytes will be found mostly in the Lymphocyte Separation Medium and erythrocytes will pellet at the bottom of the tube. References 1. Boyum, A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89. 2. Boyum, A. 1976. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 5:9-15. 3. Boyum, A. 1977. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology. 10-2:71-6. 4. Boyum, A. 1984. Separation of lymphocytes, granulocytes and monocytes from human blood using iodinated density gradient media. Methods Enzymol. 108:88-102. 5. Boyum, A. et al. 2002. Separation of Human Lymphocytes from Citrated Blood by Density Gradient (NycoPrep) Centrifugation: Monocyte Depletion Depending upon Activation of Membrane Potassium Channels. Scand. J. Immunol. 56-1:76-84. 6. Koistinen, P. 198 7. Human peripheral blood and bone marrow cell separation using density gradient centrifugation on Lymphoprep and Percoll in haematological diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 47-7:709-14. 7. Rola-Pleszczynski, M. and W.H. Churchill. 1978. Purification of human monocytes by continuous gradient sedimentation in ficoll. J. Immunol. Methods. 20:255-62. Product Use Statement THESE PRODUCTS ARE FOR RESEARCH USE ONLY. Not approved for human or veterinary use, for application to humans or animals, or for use in clinical or in vitro procedures. INST-17-829-1 06/07 Ficoll is a trademark of GE Healthcare. All other trademarks herein are marks of Lonza Group or its subsidiaries. 1
MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
淋巴细胞刺激指数
小鼠淋巴细胞刺激转化指数实验 1.小鼠淋巴细胞悬液的制备 1）小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡2-3分钟。减少污染。 2）将小鼠移入超净台内，仰卧固定在解剖盘，用眼科剪，镊子取出脾脏和胸腺（各1/2），放入装有2mL IMDM培养液的无菌平皿中。 3）将消毒好的纱布，3-4层覆盖到组织上，直头镊子固定，弯头镊子轻压组织，用移液枪反复吹打。 4）将悬液吸出，放入1.5mLEP管中，2000rpm,15-20min，吸取白色淋巴细胞层于无菌离心管中，用PBS缓冲液洗3遍。 2细胞计数 1）取上述制备好的细胞悬液混匀后，取出20mL，加到有980细mL胞计数液的EP管。 2）取20微升到细胞计数板，计数，数出四个大方格的细胞总数Y.则悬液的浓度为Y/4×104×50 3）用含有20%血清的培养液调细胞浓度至1×107/mL。 3.淋巴细胞培养 1）取含20%血清的IMDM 培养液（分别含有0g/mL,5mg/mL,10mg/mLConA)加入无菌96孔细胞培养板，每孔50mL） 2）青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。青霉素是160万单位(0.96g)/瓶，链霉素是100万单位(1g)/瓶，取青霉素0.06g，链霉素0.1g，加10ml灭菌双蒸水，配制成青链霉素1万单位的母液，过滤后分装在小EP管中。使用时，可取1ml 母液放入100ml的培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。 3）再加入调好浓度的淋巴细胞悬液，50mL/孔 4）将上述培养板放入含有5%CO2的37℃培养箱中培养48-72h 4、MTT 1)结束培养前2h，在显微镜下观察细胞转化情况。 2）每孔加入MTT 5mg/mL，10mL/孔，将MTT和细胞混匀。 3）在培养箱中继续培养2h 4）取出后离心2000rpm，10min,弃去上清。
T淋巴细胞提取
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
小鼠淋巴细胞分离方法
小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4 (22)申请日 2019.02.20 (71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高 新大道666号生物创新园C6栋C6221室 (72)发明人 娄阳 吴海 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212 代理人 胡清堂 (51)Int.Cl. C12N 5/0781(2010.01) (54)发明名称 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋 巴细胞的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离 单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用 采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以 及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用 荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而 实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速 筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的 阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至 30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克 隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单 克隆抗体的数量和多样性。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16 C N 110016462 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110016462 A 1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下： 1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度； 2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞； 3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞； 4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。 其中，所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原。 2.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。 3.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤：采用滴加方式进行偶联反应，分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联，每次滴加后孵育使其偶联充分；其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。 4.根据权利要求2或3所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤：在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后，根据偶联产物的大小，选择合适的分子筛离心管，除去未偶联的底物。 5.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)为：以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞，提高B淋巴细胞的相对丰度。 6.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。 2
2018年淋巴细胞分离
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 １小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 ２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟，20分钟。 ３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。 ４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培
养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
B淋巴细胞分离技术
B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下： 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途： 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能 稳定，细胞活性保证。 技术背景： 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容： 淋巴细胞分离液（200）毫升 产品说明书1份 产品特点： -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格
检测标准： 热源检测结果：＜0.5EU∕ml 无菌检测结果：已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1．准备无菌的锥形离心管 2．加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。 3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 （注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液） 4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g 5．小心取出离心管，切记不要震动 6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离 一、实验目的 1.熟悉细胞分离的基本原理 2.掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 3.掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法 二、实验原理 1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。 2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。 三、实验材料 小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板 平皿，尼龙膜指套、研磨棒、 吸管、试管、EP管、移液器和tips PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK） 细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 8.显微镜 四、实验步骤 （一）取小鼠脾脏 1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。 2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 （二）制备单个核细胞悬液： 1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使 单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲 洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min； 3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬 液。(放置冰上) 4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释） 5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度 a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 （三）计算细胞浓度 1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.细胞计数：细胞浓度（个/mL)=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）
淋巴细胞的分离及鉴定
离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。 6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理 盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后， 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片 2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。 4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量 的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图：
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中 小鼠脾脏的摘取 最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。大家一起讨论，把实验做得更好。 无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。 一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用 二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。 三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）
四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。脾脏走行向与肋骨方向近似平行 五，用镊子轻轻提起脾脏。脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。
六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS （混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜
七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。
八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。
九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心 十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。 十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，； 至此，脾脏细胞就算提取完成了。后面几步没有上图，但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。
T淋巴细胞分离技术
T淋巴细胞分离技术 (免疫细胞的分离、纯化和鉴定) 免疫细胞的分离、纯化技术 各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC） 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。ficoll-hypaque 混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。 【原理】 血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque 混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得PBMC。【器材与试剂】 1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等。 2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液，淋巴细胞分层液。（8.2%的聚蔗糖溶液28份，35.7%泛影葡胺10份） 【方法】 1.静脉取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血样本)的试管中，混匀，使血液抗凝。用pH7.2 Hanks液或生理盐水将抗凝血稀释1倍。
淋巴细胞分离液
使用美国Mediatech公司的cellgro淋巴细胞分离液，可显著提高分离率,分离层间隔清晰。货号：25-072-CV Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液） Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20oC 【分离目的】 方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定，计数或功能测定。 淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备，E花环试验，淋巴细胞转化试验，淋巴细胞培养（需无菌操作） 【分离原理】 人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低，根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。此次实验采用的1就是密度梯度离心法。其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。 【材料】 1、肝素抗凝管，普通管（负压），采血针，血清收集管 2、淋巴细胞分离液(比重1.077– 1.080 g/mL）。 3、无Ca++、Mg++、Hank's 液 4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。 5置于冰箱的冷丙酮（固定细胞，保持细胞的完整性） 【方法】 1．采静脉血2ml加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠），3ml加入普通管。 2．普通管斜面放置30MIN，此时可分离淋巴细胞。用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用玻璃棒），2000rPm离心20分钟，用毛细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中，于4℃冰箱保存备用，用于以后的ELISA实验，对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验，溶血反应，免疫比浊测定补体C3或C4等等。 （剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离）
达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案
小鼠淋巴细胞分离液说明书 Cat#:DKW33-R0100 本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为Iodixanol ，分子量为1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 EZ-Sep?Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。 本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达1小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和质量没有明显变化，随后的ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。 产品信息： 商品名：EZ-Sep?Mouse 1×（英文） 易得小鼠淋巴细胞分离液（中文） 规格：100mL/瓶 密 度：1.0810±0.0005g/mL (20oC) 渗透压：280±15mOsm 主要成份：Iodixanol ，化学惰性，无生物毒性 内毒素：≤0.5EU/mL 适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 分离大鼠/兔子血液中的PBMC 保存方法：4oC 避光保存，保持无菌保质期：12个月 使用方法： 自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200目尼龙网——裁 成90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求）、其他常用器材：离心管，移液管，加样枪，离心机等 实验步骤：1.断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中。2.在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3.在35mm 培养皿中放入4-5mL EZ-Sep?Mouse 1×淋巴细胞分离液（取用前摇匀）。研磨（研磨操作请参考图二）。 4.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL 离心管中，覆盖200-500uL 的1640培养基（保持液面分界明显）。 5.室温，800g 离心30min 。设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 6.吸出淋巴细胞层，再加入10mL 1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g 离心10min 收集细胞。 7. 倾倒上清液，用无血清培养基或其他培养液重悬细胞，细胞计数。 注意 ： 若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠
淋巴细胞分离
这是鄂征的《组织培养技术及其在医学研究中的应用》中关于分裂淋巴细胞的方法，可供参考。 1.概述：枸橼酸处理的全血，或加葡聚糖加速沉积去除红细胞的血浆，在Percoll-Paque分层液上分出致密层。离心后，大多数淋巴细胞会积聚在Ficoll/Metrizoate(Ficoll/甲泛葡胺）和血浆之间。 2.方法： （1）枸橼酸或肝素抗凝血携入操作室或HOOD台面 （2）用PBSA按1：1稀释，用9ml加入6mlPercoll-Paque分层液中进行分层，注入容量较大的、而且透明不带盖的离心管中，平衡 （3）400×g离心15分钟 （4）在不干扰交界面情况下，小心去除血浆/PBSA （5）用注射器或吸管吸出交界面液体（吸时最好用钝圆针头或吸管，而不要用尖的头吸 （6）用20ml不含血清培养液稀释 （7）从交界面来的稀释细胞悬浮，70g离心10分钟 （8）去掉上清，重悬沉积物于2ml不含血清培养液中；如果需要去掉血清中因子，可用20ml无血清培养基反复漂洗、离心2～3次后，最后把沉积悬于2ml 不含血清培养基中 （9）取少许细胞样品，台盼蓝染色，细胞计数器检测含有核的细胞数 （10）接种入无血清或加血清培养基中培养 注解：在第（3）步骤沉降中，淋巴细胞集中在杂有一些血小板和单核细胞的交界面上，可能也有一些粒性白细胞。如欲获纯淋巴细胞，由于单核和粒性白血病喜欢贴壁，可采用贴壁法进行排除，如向悬液中置入无菌载物玻璃片，过一定时间，这些细胞便可附着其上，抽出玻璃片弃掉；或把悬液注入培养瓶或皿中，在镜下观察，过一定时间（10～30分钟），这些细胞如先贴附，而淋巴细胞尚处在悬浮状态下，把悬液倒入另瓶中即可。当然也可应用更加复杂的方法如流式细胞仪等分离亦可 所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则 2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清 3.细节： a.淋巴细胞分离液要避光保存 b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的 c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀 d.所有操作都应在无菌环境进行 e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心 就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本 祝您好运了！