达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案 - 生物在线
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
达科为生物技术 人淋巴细胞分离管说明书
1/32/33/3表一：产品基本参数使用方法1.检查。
如图一（A ）所示。
取出分离管，观察半固体材料之上是否有游离的分离液。
如果有，请用离心机2000g ，20℃，离心1min 。
2.倒入血液。
血液样品必须为抗凝全血，无需稀释。
分离液呈半固体形态，不会与血液混合。
每支分离管可以分血分离管组成密度介质医用级别半固体组织分离液密度 1.077±0.001g/mL (20ºC)渗透压290±15mOsm 内毒素含量≤0.25EU/mL 保存条件室温避光保存保质期12个月图一：淋巴细胞分离管分离血液的过程注意事项：�分离管室温避光保存。
�最佳分离温度在18-25℃，超出该温度范围分离效果将受一定影响。
�血液在室温采集、在抗凝容器中室温存放（保存时间不要超过4hr ）、室温分离，勿放到4℃冰箱。
�全血无需稀释，可直接分离。
但稀释后不影响分离效果。
�如果全血不足3mL ，建议不要使用分离管，稀释到3mL 对分离效果没有改善。
因为不论稀释与否，红细胞的数量是恒定的，置换出的游离分离液也是恒定的，经离心后细胞聚集带仍然距离半固体组织很近，吸取操作会有一定难度。
�取走血浆的血细胞可以用生理盐水稀释一倍之后倒入分离管，以分离PBMC 。
但前提是有足够数量的红细胞（至少有相当于3mL 全血所含的红细胞）。
1046-10496.刘义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-6947.张慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-1018.王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-2429.丁隆,等.[J]第三军医大学学报,2007,29(11):1072-107510.夏婷,等.[J]中国实验血液学杂志,2006,14(4):745-74811.陈华华,等.[J]微循环学杂志,2005,15(4):6-812.陈敏,重庆医科大学博士学位论文2007制造商：深圳市达科为生物技术有限公司地址：深圳市南山区南油登良路天安工业区5栋3B (518054)Toll free ：800-8304366Tel ：+8675586235352Fax ：+8675526869149E-mail ：*************http ：//（100413）。
达科为 达优ELISPOT系列说明书-鼠IL-4预包被版
Mouse IL-4 precoated ELISPOT kit说明书Cat# : DKW22-2040-500产品描述：达科为公司生产的达优®系列ELISPOT预包被试剂盒采用原装进口高亲和力高效价抗体对，经预包被PVDF 板、低温冷冻干燥、真空密封包装等工艺流程制备。
成品PVDF板上预包被的抗体分布均匀、效价稳定，2-8 ºC 可存放12个月。
达优®系列预包被ELISPOT试剂盒使实验检测时间从3天缩短为2天，大幅度减少无菌操作的实验步骤，减轻实验者的劳动强度和减少污染的机会。
使得实验者能够轻松、高效地完成复杂的ELISPOT检测实验。
试剂盒提供的试剂、规格：名称规格（5 ×96T）Biotinylated antibody 100μL× 5Streptavidin-HRP 500μLDilution buffer R（10×） 10mLWashing buffer (50×) 25mL×2AEC dilution 25mL×2AEC solutionⅠ（20×） 5mLAEC solutionⅡ（20×） 3mLAEC solution Ⅲ（200×） 500μL预包被PVDF板5块需要实验者自行准备的试剂与仪器：1.RPMI-1640基本培养基（需要添加双抗，不需要添加血清）2.无血清培养基（完全培养基，即用型）3.超净工作台4.CO2细胞培养箱5.微量移液器及配套Tip头6.8通道微量移液器7.0.5mL, 1.5mL EP管8.Biosys Bioreader自动读板仪试剂的配制：1．Washing buffer (50×):用去离子水稀释(1:50)，制成1× Washing buffer备用。
2．Dilution buffer R(10×)：用1×PBS稀释(1:10)，制成Dilution buffer R(1×)备用。
淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[发明专利]
![淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/54d70cb7b8d528ea81c758f5f61fb7360b4c2b81.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101012449A [43]公开日2007年8月8日[21]申请号200610063555.6[22]申请日2006.11.09[21]申请号200610063555.6[71]申请人深圳市达科为生物技术有限公司地址518067广东省深圳市南山区蛇口工业六路科健大厦四楼西[72]发明人朱义鑫 [74]专利代理机构深圳创友专利商标代理有限公司代理人罗瑶[51]Int.CI.C12N 5/06 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 8 页[54]发明名称淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[57]摘要本发明公开了一种淋巴细胞分离液，所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。
本发明还公开了采用上述分离液分离脾脏淋巴细胞的方法，该方法包括：将脾脏直接在分离液中研磨，制备成单细胞悬液，并将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作。
本发明的分离液及方法无毒、便于操作且易于分离得到的状态好、活力高的淋巴细胞。
200610063555.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。
2、根据权利要求1所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的渗透压为230～310mOsm，内毒素含量小于1EU/mL，pH 值为7.0～7.2。
3、根据权利要求2所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液还包含体积百分浓度为70.8～76.7％的RPMI1640培养基以及体积百分浓度为9.3～11.7％的超纯水。
4、根据权利要求2或3所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的密度为1.077～1.095g/mL。
5、根据权利要求4所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液用于分离小鼠或大鼠的脾脏淋巴细胞。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
小鼠淋巴细胞分离
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较
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2. 3.
平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹 力。 镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑 动。
参考文献：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18 泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 Juntao Zou, et,al.[J]Journal of the Neurological Sciences,2008,5:003-007 朱 鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049 朱 鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294 刘 义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694 张 慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101 王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242
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EZ-SepTM 系列说明书
离心机转速换算公式（rpm与g）
在 有 关 离 心 机 的 实验 中， RCF(relative centrifugal field)表示相对离心场，以重力加速度g（980.66cm/s2）的 倍数来表示； rpm(revolution per minute ，或 r/min) 表示 离心机每分钟的转数。rmp与g之间的换算公式为： RCF = 1.119 x 10-5 x (rpm)2 x r
渗 透 压：280±15mOsm 主要成份：Iodixanol，化学惰性，无生物毒性
使用方法：
自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200 目尼龙网——裁 成 90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求） 、其他常用器 材：离心管，移液管，加样枪，离心机等 实验步骤： 1. 2. 3. 断颈处死小鼠，浸泡于 75%的乙醇中。 在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 在 35mm 培养皿中放入 4-5mL EZ-Sep™ Mouse 1× 淋巴细胞分离液 （取用前恢复至室温并摇匀） 。研磨（研磨操作请参考图二） 。 4. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离心管中， 覆盖 200-500 uL 的 1640 培养基（保持液面分界明显） 。 5. 室温，800g 离心 30min。设置较慢的加速度和减速度，如果有十档， 设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 6. 吸出淋巴细胞层，再加入 10mL 1640 培养基，颠倒洗涤。室温，250g 离心 10min 收集细胞。 7. 倾倒上清液，用无血清培养基或其他培养液重悬细胞，细胞计数。
48 T 96 T 5×96T 48 T 96 T 5×96T 48T 96T 48号 EZ-SepTM 名 称 规 格
DKW33-H1024
Human Lymphocyte Separation Tube 易得人淋巴细胞分离管
24 支/包
DKW33-R0100
EZ-SepTM Mouse 1× Lymphocyte Separation Medium 易得小鼠淋巴细胞分离液
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EZ-SepTM 系列说明书
分离液等体积稀释并混匀后，再进行第 4 步操作。 � � 分离液易挥发，每个脾脏的研磨时间应控制在 5min 以内。 大鼠脾脏淋巴细胞分离操作： 因大鼠脾脏较大，只须剪取一小部分进行实验即可，研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离操作完 全相同。 � 大鼠／兔子血液中淋巴细胞分离操作： 1. 2. 新鲜抽取的大鼠/兔子抗凝外周血 2-4mL 用 1640 稀释一倍 （血液稀释后分离效果更佳， 注意无菌操作）。 在 15mL 离心管中加入 3mL 淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液面上 层，避免两种液体界面混合。 3. 4. 室温，800g 离心 15~20min。设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，设为第三档） 。 后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。
100mL 100mL 250mL
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其中 r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离（如下图所 示） ，单位为 cm。由于离心管的位置由转子（rotor）决定，因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。 附：快速换算表
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EZ-SepTM 系列说明书
9.
丁 隆,等.[J]第三军医大学学报,2007,29(11):1072-1075
10. 夏 婷,等.[J]中国实验血液学杂志,2006,14(4):745-748 11. 陈华华,等.[J]微循环学杂志,2005,15(4):6-8 12. 陈 敏.重庆医科大学博士学位论文 2007
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注意： � 若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠
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EZ-SepTM 系列说明书
小鼠淋巴细胞分离液说明书
Cat# : DKW33-R0100
本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为 Iodixanol，分 子量为 1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰 任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 EZ-Sep™ Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴 细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。 本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达 1 小时，离心分离后，淋巴细胞的 数量和质量没有明显变化，随后的 ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。
产品信息：
商 品 名：EZ-Sep™ Mouse 1×（英文） 易得小鼠淋巴细胞分离液（中文） 规 密 格：100mL/瓶 度：1.0810±0.0005g/mL (20 ºC) 内 毒 素：≤0.5EU/mL 适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 分离大鼠/兔子血液中的 PBMC 保存方法：4 ºC 避光保存，保持无菌 保 质 期：12 个月
特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法：
� � � 推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。 推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。 关键所在，利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力 度。将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。 注意： 1. 控制研磨力度，使尼龙网保持悬空，避免在皿底上直 接研磨而造成大批细胞死亡。
100mL
3. 淋巴细胞冻存液
货 号 名 称 规 格
UH-M1002-050
CryostarTM Lymphocyte Freezing Medium
50mL
4. ELISPOT 无血清培养基
货 号 名 称 规 格
DKW34-P0100 DKW34-R0100 UH-M1005-025
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