小鼠淋巴细胞分离方法
小鼠免疫器官的识别分离实验报告
小鼠免疫器官的识别分离实验报告
一、实验目的
1、明确各免疫器官分布与形态结构,熟练找到各免疫器官,弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系.
2、拿握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法,熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能.
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一,是人体最大的淋巴器宫.它生在腹腔左上方,质地比较脆,容易外伤.一般来讲脾脏有三大功能首先它是人体的"血库",当人体休息、安静时,它贮存血液,当处于运动、失血、缺氧等应激状态时,它又将血液排送到血循环中,以增加血容量:
其次,脾脏犹如一台"过滤器",当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时,脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉此外,脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,发挥免疫作用.脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板.因此,脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少.脾脏还有产生淋巴细胞的功能.
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞.
小鼠淋巴细胞的比重为1.088,利用比重为1.088的淋巴细胞分离液,将脾细胞县液置于分离液上层,通过梯度离心的方法,在分离液与脾细胞县液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞.
三、实验器材KM种小鼠,PBS缓冲液,淋巴细胞分离液,200目不锈钢网,解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠,取出小鼠的脾脏,在pbs缓冲液中冲洗干净.
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中,铜网绑定在烧杯上面,剪碎、碾磨,边碾磨边加PBS冲洗,制得脾细胞晨液.
3、将制得的脾细胞晨液转移到10ml的离心管中,1000r/min5min离心洗涤,倒掉上清,加入5 mIPBS再离心洗涤一次.。
小鼠单个核细胞分离
小鼠单个核细胞分离
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操作步骤：
1. 将2ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用 滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液试管壁 轻轻铺于分离液面上。
2. 将该试管置水平式离心机中1800rpm离 心15min。
3. 用滴管小心直接插入白色絮状细胞层， 吸出界面层细胞，移入另一试管中。
小鼠单个核细胞分离
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操作步骤：
小鼠单个核细胞分离
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原理：
依据物理学颗粒沉降原理，不一样密度颗粒在其沉降 运动中可因其比重差异而处于不一样分布位置。利用 此原理可设计一定比重液体界面，将小鼠脾脏中各种 不一样比重细胞经过离心沉降而到达使其彼此分离目 标。
小鼠单个核细胞分离
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原理：
已知小鼠淋巴细胞和单核细胞比重为1.088左右，而 红细胞与粒细胞比重均大于1.088。所以，若用比重 为1.088±0.001分离液则可经过密度梯度离心方法， 在分离液界面上搜集得到脾单个核细胞。
2. 分离时所取离心速度与时间，因各台离 心机离心半径而异，需事先经过预试验 决定。
3. 加入稀释血时应十分小心，注意保护试 管内界面，勿使混同影响分离效果。
4.
小鼠单个核细胞分离
做细胞活力检验时，锥兰染色后应尽快
计数完成，时间过长则细胞活力可能降 低。
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试验结果统计与分析
经过前后两次细胞计数：
取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一 试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数， 计算出淋巴细胞浓度（个/ml）。
检验细胞活力：取细胞悬液一滴，加入等量锥 兰溶液于另一试管中，充分混匀后马上滴一滴 细胞悬液于载玻片上，在显微镜下计数 100~200个淋巴细胞中着色死细胞数。
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定是用来评估免疫功能和细胞毒性的常用方法。
以下是一般的小鼠淋巴细胞增殖测定的步骤：
1. 准备小鼠：选择合适的小鼠品系和年龄，并确保小鼠健康。
2. 分离淋巴细胞：采集小鼠淋巴组织（例如脾脏或淋巴结）并进行细胞分离。
常用的方法包括机械破碎和离心分离。
3. 细胞计数与稀释：用血细胞计数器或显微镜计数细胞数目，并进行适当的稀释以获得合适的细胞密度。
4. 细胞悬液制备：将分离的淋巴细胞与培养基混合，使细胞悬浮于培养基中。
5. 细胞培养：将细胞悬液移至培养皿中，并在37°C、5% CO2
的条件下培养一段时间。
一般培养24-72小时。
6. 刺激因子处理：在培养皿中添加适当的刺激因子（如细胞激动剂或抗原），以刺激细胞增殖。
7. 溶菌酶处理：在培养结束后，加入溶菌酶等溶解剂，使未被细胞内的放射性同位素取代的DNA释放到培养基中。
8. 获得DNA：收集并离心细胞上清液，将其中的DNA沉淀。
9. 放射性测定：使用放射性技术，如液体闪烁计数器，测量
DNA中的放射性同位素含量。
10. 统计分析：根据放射性同位素的计数，计算细胞增殖水平，并进行统计分析。
这些步骤可以根据具体实验目的和方法的需求进行适当的调整和修改。
淋巴细胞增殖实验报告
淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。
二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。
2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。
3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。
3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。
4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。
5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。
四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。
2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。
3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。
4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。
小鼠CD8+记忆性T淋巴细胞的分离、纯化和体外功能检测
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小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。
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达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案 - 生物在线
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2. 3.
平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹 力。 镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑 动。
参考文献：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18 泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 Juntao Zou, et,al.[J]Journal of the Neurological Sciences,2008,5:003-007 朱 鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049 朱 鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294 刘 义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694 张 慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101 王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242
3/4
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EZ-SepTM 系列说明书
小鼠淋巴细胞分离
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
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小鼠淋巴细胞分离方法
一、实验用品的准备：
1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20µl枪头、200µl
枪头、1000µl枪头。
摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒；
2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个；
200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个；
5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10
把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）；
注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。
二、相关实验：
（一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞
实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。
实验动物：BABALB/c小鼠；雌性
实验材料：
1．小鼠淋巴细胞分离液,
2．60mm玻璃培养皿
3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌
4．气管切开包
5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机
6．1640培养基
实验方法
1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。
注意无菌操作。
3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。
4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。
5. 3000转离心15分钟。
（病毒室离心机）
6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。
7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。
8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
实验试剂用量：
1．小鼠淋巴细胞分离液：60 mL 2．1640基础培养基：80 mL 3．5%FCS1640培养基：50Ml。