小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书
【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：
名称
产品编号
规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份
A B C D E
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书
【实验前准备】A ．适用仪器
最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材
产品名称产品货号339650339651339652339653
产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC
50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。
2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于
3ml ）。
3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注：
根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋
巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入
10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。
6.250g，离心10min。
7.弃上清。
8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
9.250g，离心10min。
10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
【注意事项】
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最
好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离
心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒
细胞数量增加。
4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。
5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。
【储存条件及有效期】
18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】
本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。
红细胞白细胞血小板
（4.0-10.0）×109
含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011
中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
50%-70%20%-40%3%-8%
【相关实验技术方案】
1.组织单细胞悬液制备技术。
2.所获得淋巴细胞的培养技术。
3.所获得淋巴细胞的核酸提取技术。
4.所获得淋巴细胞的鉴定方法
A.流式细胞技术
B.免疫组化技术
C.原位杂交技术
D.PCR技术
注：上述技术方案详情请登陆上海研谨生物科技公司官网搜索“细胞分离、
纯化、扩增、鉴定及生物治疗技术手册”，并在说明书项目栏下下载使用。
【可能存在的问题及解决方法】
1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
出现情况出现原因建议解决方案
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层离心后目的细胞存在于分离液中
离心后白环层弥散转速过小或离心时间过短
转速过大或离心时间过长
细胞密度过大
适当增减转速
调整细胞密度
离心后白环层太浅或看不见细胞密度过小
2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地
区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
3.本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可
能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以50-100g为基数，直至达到最佳分离效果，离心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。离心时间以20-30min为准。
淋巴细胞的分离方法
1、淋巴细胞的来源： 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法： 1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2） 3、20℃，1500r/min，离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%～95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。 该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
[医学类试卷]皮肤与性病学中级(专业知识)模拟试卷1.doc
[医学类试卷]皮肤与性病学中级（专业知识）模拟试卷1 1 Ⅲ型变态反应引起的皮肤疾患不包括 （A）药物引起的血清病样综合征 （B）血清病 （C）某些荨麻疹 （D）血管炎 （E）接触性皮炎 2 角化不良不见于 （A）毛囊角化病 （B）日光角化病 （C）鳞状细胞癌 （D）Bowen病 （E）湿疹 3 神经痛常见于 （A）单纯疱疹 （B）带状疱疹
（C）麻风 （D）结节性红斑 （E）生殖器疱疹 4 以下哪种抗生素对革兰氏阳性菌无效 （A）替考拉宁 （B）左氧氟沙星 （C）氨曲南 （D）头孢拉定 （E）美罗培南 5 下列疾病可能引起面瘫、耳痛及外耳道疱疹三联征的是（A）麻疹 （B）风疹 （C）猩红热 （D）带状疱疹 （E）单纯疱疹 6 以下哪种不是角质促成剂
（A）2％～5％煤焦油 （B）3％水杨酸 （C）3％～5％的硫磺 （D）0．1％～0．5％的蒽林 （E）5％～10％乳酸 7 治疗皮肤结核常用三联疗法，下列属于三联疗法用药的是（A）异烟肼，利福平，乙胺丁醇 （B）异烟肼，利福平，对氨基水杨酸 （C）异烟肼，乙胺丁醇，链霉素 （D）异烟肼，对氨基水杨酸，链霉素 （E）异烟肼，利福平，链霉素 8 疥螨最容易发现的部位是 （A）肘窝 （B）手指间 （C）腋窝 （D）腹股沟
（E）胭窝 9 以下对花斑癣描述错误的是（A）好发于胸、腹、上臂及背部（B）Wood灯下可见棕黄色荧光（C）皮屑可找到真菌感染依据（D）好发我国北方地区 （E）内服抗真菌药物有效 10 以下关于梅毒描述错误的是（A）二期梅毒不发生脱发（B）树胶肿可形成溃疡 （C）梅毒性骨膜炎常侵犯长骨（D）麻痹性痴呆常见于梅毒患者（E）夏科关节病常发生在大关节11 下列哪种疾病不是梅毒的症状（A）骨骼树胶肿 （B）鞍鼻
肿瘤浸润淋巴细胞
肿瘤浸润淋巴细胞 1概念 1986年Rosenberg研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）。TIL细胞表型具有异质性，一般来说，TIL 中绝大多数细胞CD3阳性。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细 胞的比例有差异，大多数情况下以CD8+T细胞为主。新鲜分离的TIL中CD25+细 胞百分率较低，随着体外加IL-2培养时间的延长，CD25+细胞百分率逐渐升高。 NK细胞的标记（CD16，CD56）在 TIL体外加IL-2培养过程中有先增高后降低的 趋势。 2特点 用机械处理和酶消化方法，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润的淋巴细胞，加入高 剂量IL-2体外培养，残存的肿瘤细胞7-13天全部死亡。经IL-2活化的TIL与 来自PBMC的LAK细胞比较，其特点是：（1）50-100倍，因此在治疗中可以减 少效应细胞和IL-2的用量，而且对LAK治疗无效的晚期肿瘤仍有一定治疗效果； （2）主要由CD8阳性细胞诱导而来，在动物实验中发现TIL杀伤肿瘤作用具有 特异性；（3）宿主的抑制状态有利于TIL的杀伤作用，因此治疗时加用环磷酰 胺（Cy）100mg/kg可明显提高疗效，可能与免疫抑制药能消除抑制性细胞或因 子，增强过继免疫治疗作用有关，因而可减少IL-2的用量，降低毒副反应；（4） 可从手术切下肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中获得淋巴细胞，经加 IL-2培养后，其生长、扩增能力强于LAK细胞。已有报道应用TIL治疗14例转 移性肺癌等晚期肿患者，其中4例肿瘤缩小50%以上，副作用明显低于IL-2/LAK 疗法。 免疫系统 ?中枢免疫器官?免疫器官?外周免疫器官 ?淋巴器官?中枢淋巴[样]器官?周围淋巴[样]器官?胸腺?胸腺小体?胸腺基质 ?骨髓?法氏囊?脾[脏] ?红髓?白髓?围动脉淋巴鞘 ?B细胞冠区?边缘窦?边缘区 ?淋巴结?初级淋巴滤泡?生发中心
皮肤淋巴细胞浸润症1例
皮肤淋巴细胞浸润症1例 摘要 患者女，37岁，因面部反复出现红色斑块3年，于2013年2月13日来诊。 患者3年前面部出现少数散在红色小丘疹，无自觉症状，日晒后加重，1年前面 部皮疹逐渐扩大成斑块，胸部亦出现类似皮疹。患者发病后，曾自行外用“速 奇”(糠酸莫米松乳膏)，肤轻松等药物无效。多次在外院诊断为“慢性皮炎”，予抗 炎药和抗组胺药治疗，皮疹持续存在。既往体健，无药物过敏史。否认外伤及蚊 虫叮咬史。 体格检查：一般情况好，各系统检查无特殊。皮肤科检查：额部、面颊、胸 部可见黄红色斑丘疹，颊部皮疹部分融合成片状皮疹表面光滑无鳞屑，无毛囊角 化过度现象，少数皮疹中心消退呈环状。皮肤组织病理学检查(胸部皮损)：表皮 正常，真皮内胶原纤维增多,附件消失,真皮浅层及皮下脂肪、血管周围可见较多 淋巴细胞浸润。免疫组化提示浸润以CD4+T淋巴细胞为主。诊断：皮肤淋巴细胞 浸润症。 治疗与转归：外用0.1%他克莫司软膏，2次/日，口服羟氯喹0.2g, 2次/日,治 疗1个月后，患者皮损明显消退。随访1年，患者病情时常反复。 2、讨论 皮肤淋巴细胞浸润症(LIS)又称为Jessner-Kanof综合征和Jessner皮肤淋巴细胞 浸润症。本病的特点为紫红色或黄红色浸润性斑块，好发于面部，表面光滑。无 自觉症状，病程慢性，经过良性。实验室检查一般无异常[1]。 本病原因不明。有人认为本病为盘状红斑狼疮(DLE)的亚型，而另一些人则认 为本病是皮肤淋巴细胞瘤的一型[2]。中医学认为其发病与情志内伤及饮食不节、 脏腑功能失调有关[3]。 本病的诊断主要根据皮疹分布部位，形态和病理改变，病理诊断对本病有重 要价值。在鉴别诊断中必须和DLE、多形性日光疹、皮肤淋巴瘤、面部肉芽肿等 疾病进行鉴别。DEＬ在组织病理上以表皮改变为主，显示表皮角化过度，有角栓，棘层萎缩，基底细胞液化变性，皮损处狼疮带试验阳性，而无真皮及皮下大片淋 巴细胞浸润。多形性日光疹的皮疹为多形性，病理上变异较大，不像ＬＩＳ那样 单一。皮肤淋巴瘤的皮疹较稳定，病理上淋巴样细胞异形性较为明显，并形成淋 巴样滤泡。面部肉芽肿的炎症细胞浸润呈多形性，以中性粒细胞和嗜酸粒细胞为主，可见核尘和含铁血黄素沉着，有毛细血管的炎症性改变。 系统应用氨苯砜[4]、甲胺蝶呤都有成功治疗ＬＩＳ的报道，有单独外用0.03%他克莫司软膏治愈ＬＩＳ的报道[5]。少量皮疹可采用糖皮质激素局部注射治疗。 参考文献 [1]朱学骏，涂平.皮肤病的组织病理诊断M.北京：北京大学医学出版 社,2001:74. [2]赵辨.中国临床皮肤病学M.南京：江苏科学出版社，2010：924. [3]蔡蓉，陈可平.中药治疗皮肤淋巴细胞浸润症1例J.北京中医 药,2013:32(5):384. [4]王信环.氨苯砜成功治疗皮肤淋巴细胞浸润一例J.临床误诊误治,20 04:17(12):844. [5]孟静, 于建斌,张江安.他克莫司软膏治疗皮肤淋巴细胞浸润症疗效观察J.中 国皮肤性病学杂志,2008:22(5):317.
小鼠免疫细胞
免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取 一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。 二、实验原理 脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。一般来讲，脾脏有三大功能： 首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量； 其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉； 此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。 我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。 小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。 三、实验器材 KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械 四、实验步骤 1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS 冲洗，制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。
肿瘤浸润淋巴细胞在人黑色素瘤组织中的形态学观察(一)
肿瘤浸润淋巴细胞在人黑色素瘤组织中的形态学观察(一) 作者：谢遵江，贺业春，贾立敏，刘颖，刘丽，郑金华 【摘要】目的探讨人黑色素瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocyte，TIL）的形态学特征。方法采用光镜、透射电镜和免疫组化方法观察9例人皮肤黑色素瘤组织中TIL的分布及形态变化。结果肿瘤浸润淋巴细胞主要分布在癌周区，病变早期，TIL数量多、集中分布；病变晚期，TIL数量少、散在分布。病变早期TIL数量明显高于病变晚期（P0.01）。电镜下，可见肿瘤浸润淋巴细胞核大，胞质少，核较圆。TIL与肿瘤细胞有接触。结论本试验提示黑色素瘤组织中TIL数量多少与肿瘤的进展有关。TIL与肿瘤细胞关系密切。 【关键词】黑色素瘤；肿瘤浸润淋巴细胞；形态学【Abstract】ObjectiveTostudythemorphologicalcharacteristicsoftumorinfiltratinglymphocytes(TIL)intumortiss ueofhumanmelanoma.MethodsThedistributiveandmorphologicalchangesofTILwereobservedbylig htmicroscopy，electronmicroscopyandimmunohisochemistry.ResultsTILmainlyappearedinthetumor-surrounding tissue.ThenumberofTILwasmoreandconcentrateddistributionintheearlierstage，butitwasalittleanddecentralizeddistributioninthelaterstage.ThenumberofTILwasmuchmoreinthee arlierstagethaninthelaterstage(P0.01).Underelectronmicroscope，thenucleusofTILwasbig.ThecytoplasmofTILwaslittle.Thenucleuswasroundinshape.Thereweretheco ntactsbetweenTILandtumorcell.ConclusionThenumbersofTILarerelatedtotheprogressoftumor.The reisacloserelationshipbetweenTILandtumorcell. 【Keywords】melanoma；tumorinfiltratinglymphocyte；morphology 肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocyte，TIL）是以T细胞为主的一个异质性淋巴细胞群体。有关TIL的研究多集中在肿瘤生物学治疗方面，以及在肿瘤组织中的浸润程度对肿瘤病人生存预后影响的研究〔1〕，但对有关TIL的形态学研究较少。本文通过CD3在黑色素瘤组织中的表达和电镜方法对人黑色素瘤组织中浸润淋巴细胞的形态进行研究，为研究TIL 的功能提供形态学基础。 1材料与方法 1.1试验材料人黑色素瘤标本9例，取自早晚期不同的病变阶段的手术病人。由哈尔滨医科大学附属第一、第二医院提供。根据临床表现和病理特征及临床病理诊断，将黑色素瘤分为病变早期（5例）和病变晚期（4例）两部分。 1.2取材方法根据病人病情（早、晚期），临床手术切取黑色素瘤新鲜组织标本，当即以双馏水清洗，再以0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗，取黑色素瘤组织，一部分经10%福尔马林液固定，制成石蜡切片，HE染色；另一部分经3%戊二醛固定，电镜样品制备，光镜和电镜观察。1.3免疫组织化学方法黑色素瘤周组织经4%福尔马林液固定后，制成4μm石蜡切片。切片经脱蜡后用PBS漂洗，一抗采用兔抗人CD3抗体（武汉博士德生物工程有限公司），二抗采用山羊抗兔IgGSABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），按使用说明书程序操作。1.4常规透射电镜观察常规透射电镜样品制备，透射电镜观察。 1.5统计学方法对病变早期和晚期CD3免疫组化染色切片进行观察，选择CD3阳性细胞最多处，观察5个高倍视野（×40）进行阳性细胞计数，并进行统计学处理。 2结果 2.1免疫组化（CD3）观察每例标本均可见CD3阳性细胞，主要分布在乳头层和癌周围及癌巢内。CD3表达在T淋巴细胞上。被染成棕黄色的TIL呈圆形，胞浆少，核大，其分布均匀、密集。在病变早期，TIL数量多，以集中分布为主。病变晚期，TIL数量少，多数散在分布，少数呈集中分布。通过在病变早期（72.31±5.64）和晚期（2 3.72± 4.53）TIL数量的比较，两者之间差异有非常显著性，P0.01。
小鼠淋巴细胞分离方法
小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
T淋巴细胞提取
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
病理学实验强大总结版
IJ3:肝细胞坏死（周围有正常结构，故注意与之区分鉴别，对比着看！） 1、低倍镜下肝细胞基本保存完整，看到完整肝细胞结构时即锁定肝中央静脉区！ 2、高倍镜时可看到坏死灶内肝细胞索结构消失，成为一些相互分离、深红的、形态不规则的小碎块，即为坏死的肝细胞。 3、最终确定准则，看到核固缩、核碎裂和核溶解。（多数为深红色） IJ4、脾细动脉玻璃样变： 1、低倍镜下见脾被膜、脾小梁、脾小体及脾窦等正常结构。到此处时注意转向脾细动脉。 2、高倍镜下中央动脉管壁呈明显的不对称性增厚，管壁成均质红染结构，原有血管结构基本消失。 IJ5、肝细胞水变性和气球样变 1、低倍镜下见肝脏结构基本保持完整，但明显感觉局部浅染（多为中央静脉周围）。 2、高倍镜下可见部分细胞体积明显增大，胞浆淡染，可见红染细颗粒样物和一些界限不清的空泡，胞核仍位于中央。其中体积为正常肝细胞3~4倍，胞浆透明，状如气球的为气球样变的肝细胞。 RP1、肉芽组织 1、低倍镜下观察整个切片，可见大量的骨骼肌组织，其上方为创面，可见肉芽组织。 2、高倍镜下可见大量的毛细血管，管壁多为单层内皮细胞，管腔较大。 纵切面毛细血管长轴与肉芽组织表面垂直。可见成纤维细胞（梭形，核椭圆，染色质浅、核仁清楚，胞质丰富）和炎性细胞（中性粒细胞和淋巴细胞）浸润，还有少量均质红染的纤维素。 HD1、慢性肺淤血 一、早期（貌似考试片子是晚期，不是很确定，先写上） 1、低倍镜下可见肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡壁明显增厚，肺泡腔内充满粉红色均质物质，即为含蛋白质的水肿液。 2、高倍镜下可见肺泡腔内有多少不等的红细胞（高度淤血造成的漏出性出血），有的中可见脱落的肺泡上皮细胞。 二、晚期 1、肺泡壁毛细血管扩张，肺泡壁及间质有一定程度的纤维增生。肺泡腔内水肿不明显。 2、重点是观察胞浆充满棕黄色颗粒的心衰细胞（体积较大，含含铁血黄素）。 HD2、慢性肝淤血 1、低倍镜下可见明显的肝窦变宽（正常时肝索：肝窦=2:1，慢性肝淤血时可变小甚至逆转），然后迅速转到门管区及中央静脉周围。 2、中央静脉扩张、充血、管壁增厚。肝窦明显扩张，肝细胞索则被压迫萎缩。 3、高倍镜下见肝小叶周边及淤血区附近肝细胞体积增大，胞浆内出现多数大小不一、界限清楚的圆形空泡。“月锄变形” 4、可尝试寻找脂肪变性。 5、之后可拿片子肉眼观，看是否有“槟榔肝”现象？？（待判断，以前未有观察）
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 １小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 ２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟，20分钟。 ３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。 ４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培
养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
皮肤病英语词汇
病毒性皮肤病 单纯疱疹herpes simplex 水痘varicella; chicken pox 带状疱疹herpes zoster kaposi水痘样疹Kaposi’s varicelliform eruption 幼儿急诊exanthema subitum 挤奶人结节Milker's node 传染性软疣molluscum contagiosum 寻常疣verruca vulgaris 跖疣plantar wart, verruca plantaris 扁平疣flat wart, verruca plana 丝状疣verruca filiformis 鲍温样丘疹病bowenoid papulosis 疣状表皮发育不良verruca filiformis 小儿丘疹性肢端皮炎infantile papular acrodermatitis 麻疹measles 风疹rubella 手足口病hand-foot-mouth disease 传染性红斑erythema infectiosum 急性发热性皮肤粘膜淋巴结综合征（川畸病） Kawasaki disease 细菌性皮肤病 脓疱疮impetigo 毛囊炎folliculitis 须疮sycosis 须部假性毛囊炎pseudofolliculitis barbae 秃发性毛囊炎folliculitis decalvans 疖与疖病furuncle and furunculosis 痈carbuncle 蜂窝织炎cellulitis 化脓性汗腺炎hidradenitis suppurativa 猩红热scarlatina 丹毒erysipelas 臁疮ecthyma 下疳样脓皮病chancriform pyoderma 脓疱性细菌疹pustular bacterid 化脓性甲沟炎pyogenic paronychia 麻风leprosis
2018年淋巴细胞分离
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：
组织病理简答题
1牙龈固有层胶原纤维分为哪些？ 答：1）龈牙组：自牙颈部牙骨质向牙冠方向散开，止于游离龈和附着龈的固有层，广泛地分布在牙龈固有层中，是牙龈纤维中最多的一组，主要是牵引牙龈使其与牙紧密结合； 2）牙槽龈组：自牙槽嵴向牙冠方向展开，穿过固有层止于游离龈和附着龈的固有层中； 3）环行组：位于牙颈周围的游离龈中，呈环行排列，常与邻近的其他纤维束缠绕在一起，有助于游离龈附着在牙上； 4）牙骨膜组：自牙颈部的牙骨质，越过牙槽突外侧皮质骨骨膜，进入牙槽突，前庭肌和口底； 5）越隔组：是跨越牙槽中隔，连接相邻两牙的纤维，只存在于牙邻面，起于结合上皮根方的牙骨质，呈水平方向越过槽嵴，止于邻牙相同部位，保持牙弓上相邻两牙的接触，阻止其分离。 2.简述牙周膜五组纤维的改变及功能。 答：1）牙槽嵴组：功能是将牙向牙槽窝内牵引，对抗侧方力，保持牙直立； 2）水平组：是维持牙直力的主要力量，防止牙侧方移动； 3）斜行组：可将牙承受的咀嚼压力转变为牵引力，均匀地分散到牙槽骨上，并可限制牙的转动； 4）根尖组：具有固定牙根尖的作用，保护进入根尖孔的血管和神经； 5）根间组：有防止牙根向冠方移动的作用。 3.试述上皮异常增生的变化。 答：1）上皮基底细胞极性消失；2）出现一层以上基底样细胞；3）核浆比例增加；4）上皮钉突呈滴状；5）上皮层次紊乱；6）有丝分裂相增加，可见少数异常有丝分裂；7）上皮浅层1/2处出现有丝分裂；8）细胞多形性；9）细胞核浓染；10）核仁增大；11）细胞粘着力下降；12）在棘细胞层中单个或成团细胞角化。 4.简述口腔粘膜病的基本病理变化。 答：1）过度角化；2）角化不良；3）棘层增生；4）上皮异常增生；5）萎缩；6）海绵形成；7）基底细胞空泡性变及液化；8）气球变性；9）网状变性；10）细胞凋亡；11）棘层松解；12）糜烂；13）溃疡；14）皲裂；15）假膜；16）斑；17）丘疹；18）嗜碱性变性；19）痂；20）疱。 5.牙周膜的结构组成有哪些？ 答：1）成纤维细胞；2）成牙骨质细胞；3）上皮剩余；4）成骨细胞和破骨细胞；5）未分化间充质细胞。 6.简述龋病的好发部位。 答：龋病好发于牙上食物滞留、菌斑堆积而不易清洁的部位。在恒牙，最常见于下颌第一磨牙，以后依次为下颌第二磨牙、上颌第一磨牙、上颌第二磨牙、前磨牙、第三磨牙、上颌前牙、下颌前牙。在乳牙，最常见于下颌第二乳牙，以后依次为上颌第二乳磨牙、第一磨牙、乳上颌前牙、乳下颌前牙。最好发牙面及部位为咬合面点隙窝沟，其次为邻面接触点下方，再次为唇颊面的近龈缘牙颈部及及磨牙颊侧点隙。 7牙本质龋的特点是什么？ 答：1）由于牙本质含有相对高的有机成分，大约占重量的20%，所以累及到牙本质的龋性损害除了有无机晶体的溶解外，还存在有机基质的分解破坏。 2）牙本质全层均存在牙本质小管，内含成牙本质细胞突起，龋蚀沿牙本质小管进展，病程较快。 3）牙髓牙本质为一复合体，龋病发生时，甚至在龋到达牙本质前，牙髓组织即可出心防御反应，表现为修复性牙本质、硬化牙本质的形成。
B淋巴细胞分离技术
B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下： 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途： 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能 稳定，细胞活性保证。 技术背景： 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容： 淋巴细胞分离液（200）毫升 产品说明书1份 产品特点： -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格
检测标准： 热源检测结果：＜0.5EU∕ml 无菌检测结果：已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1．准备无菌的锥形离心管 2．加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。 3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 （注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液） 4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g 5．小心取出离心管，切记不要震动 6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml） 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层
图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min 7.弃上清液，加入4mlPBS待用
病理实习镜下描述
肝 1.肝细胞水样变性：肝小叶结构紊乱，肝索拥挤；肝细胞体 积明显增大，大小不等，肝窦扭曲、狭窄、闭塞。肝细胞胞浆疏松变空，部分细胞呈球状增大，胞浆透明呈空泡状，为气球样变。 2.肝脂肪变性：肝小叶结构存在，大部分肝细胞体积增大， 致肝索拥挤、紊乱，肝窦扭曲、狭窄甚至消失。大部分肝细胞胞浆内有大小不等的圆形空泡，边缘清楚；有的空泡较大，将细胞核挤向一侧。 3.肝细胞坏死：汇管区周围肝细胞大量坏死，肝细胞或毛细 血管内有黄褐色胆色素颗粒或团块，有的肝细胞发生脂肪变性。核：固缩、碎裂、溶解。 4.慢性肝淤血：肝脏正常小叶结构存在，肝小叶中央区大量 红细胞淤积。中央静脉及周围肝窦扩张充血，该区肝细胞萎缩甚至消失。小叶周边区肝细胞有不同程度的脂肪变性，肝细胞胞浆内有大小不等的脂肪空泡。 5.肝细胞性肝癌：癌细胞呈多边形，排列成梁柱或片巢状， 其间有扩张的血窦或毛细血管。 AHA12GAGGAGAGGAFFFFAFAF
6.急性重型肝炎：肝细胞严重广泛坏死，肝窦扩张充血、出 血，库普弗细胞增生、肥大，并出现吞噬现象。残留的肝细胞无再生。小叶内及汇管区有淋巴细胞、巨噬细胞为主的炎细胞浸润。 7.门脉性肝硬化：肝脏正常小叶结构消失，增生的纤维组织 将肝小叶分割成大小不等的圆形、椭圆形的肝细胞团，即假小叶。假小叶肝细胞排列紊乱，中央静脉缺如或偏位，肝小叶内肝细胞出现胞浆疏松化、脂肪变性，甚至小灶性坏死。纤维组织内可见增生的小胆管及淋巴细胞浸润。8.坏死后性肝硬化：肝小叶正常结构破坏，肝内大量纤维组 织增生。假小叶呈灶状、带状。在大结节内有的可见几个完整的肝小叶。假小叶内肝细胞变性、坏死明显，可见胆色素沉着，肝细胞再生明显。增生的小叶间纤维间隔较宽且薄厚不均，其中炎细胞浸润，小胆管增生较显著。 肺 9.慢性肺淤血：肺组织呈弥漫一致性实变。肺泡壁和间质毛 细血管扩张充血，肺泡壁增宽，肺泡腔内有蛋白水肿液、 AHA12GAGGAGAGGAFFFFAFAF