小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法小鼠骨髓免疫细胞分离骨髓是造血的场所，含有各种类型的免疫细胞，包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和髓系干细胞。
分离这些细胞对于研究免疫系统、干细胞生物学和疾病机制至关重要。
以下是分离小鼠骨髓中免疫细胞的详细方法：材料：小鼠PBS（pH 7.2-7.4）细胞培养液（例如 RPMI 1640）琼脂糖琼脂（0.5% w/v）40 µm细胞过滤器50 mL离心管移液器台式离心机步骤：1. 屠宰小鼠：使用二氧化碳或异氟烷麻醉小鼠，然后通过颈椎脱臼法将其屠宰。
2. 取出股骨：将小鼠固定在工作台上，用无菌镊子和剪刀小心取出股骨。
3. 暴露骨髓：使用无菌剪刀剪开股骨两端，用 PBS 冲洗髓腔，将骨髓液冲入一个 50 mL 离心管中。
4. 过滤细胞：用 40 µm 细胞过滤器将骨髓液过滤到另一个50 mL 离心管中。
5. 离心细胞：以300 × g 的速度离心 10 分钟，除去沉淀的骨骼碎片和未裂解的细胞。
6. 收集沉淀：小心地吸出上清液，并收集沉淀的细胞。
7. 再悬浮细胞：用细胞培养液将细胞重悬浮，调整细胞密度至1-2 × 10^6 个细胞/mL。
免疫细胞的分离：分离免疫细胞需要专用的抗体和磁珠。
不同的抗体靶向不同的细胞表面标志物，使特定细胞类型与磁珠结合。
磁珠与细胞的结合强度取决于抗体的亲和力和细胞表面标志物的表达水平。
1. 抗体标记：向细胞悬液中加入抗体，孵育 30 分钟，4°C。
2. 磁珠孵育：加入与抗体匹配的磁珠，孵育 15 分钟，4°C。
3. 磁分离：将细胞悬液转移到磁分离柱上，放置在磁架上。
靶细胞将被磁珠吸附在柱上，而未标记的细胞将流出。
4. 洗涤：用 PBS 洗涤磁柱多次，除去未结合的细胞和抗体。
5. 洗脱：使用洗脱缓冲液将靶细胞从磁珠上洗脱，收集洗脱液中的细胞。
细胞分析：分离的免疫细胞可以使用流式细胞术进行分析。
小鼠免疫器官的识别分离实验报告
小鼠免疫器官的识别分离实验报告
一、实验目的
1、明确各免疫器官分布与形态结构,熟练找到各免疫器官,弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系.
2、拿握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法,熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能.
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一,是人体最大的淋巴器宫.它生在腹腔左上方,质地比较脆,容易外伤.一般来讲脾脏有三大功能首先它是人体的"血库",当人体休息、安静时,它贮存血液,当处于运动、失血、缺氧等应激状态时,它又将血液排送到血循环中,以增加血容量:
其次,脾脏犹如一台"过滤器",当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时,脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉此外,脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,发挥免疫作用.脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板.因此,脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少.脾脏还有产生淋巴细胞的功能.
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞.
小鼠淋巴细胞的比重为1.088,利用比重为1.088的淋巴细胞分离液,将脾细胞县液置于分离液上层,通过梯度离心的方法,在分离液与脾细胞县液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞.
三、实验器材KM种小鼠,PBS缓冲液,淋巴细胞分离液,200目不锈钢网,解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠,取出小鼠的脾脏,在pbs缓冲液中冲洗干净.
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中,铜网绑定在烧杯上面,剪碎、碾磨,边碾磨边加PBS冲洗,制得脾细胞晨液.
3、将制得的脾细胞晨液转移到10ml的离心管中,1000r/min5min离心洗涤,倒掉上清,加入5 mIPBS再离心洗涤一次.。
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1. 培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2. 脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3. 无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4. 选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5. 用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6. 脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7. 离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8. 在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9. 在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法骨髓是一种重要的免疫器官，它主要负责成熟和存储多种不同类型的免疫细胞，如粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等。
因此，分离小鼠骨髓中的免疫细胞对于研究免疫系统的功能和生理学意义具有重要意义。
本文将介绍一种常用的分离小鼠骨髓中免疫细胞的方法。
一、实验材料准备1.小鼠骨髓2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）3.甘露糖4. L-精氨酸血红蛋白（LymphoprepTM）离心管二、小鼠骨髓分离1.从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓。
用PBS冲洗骨髓，使之保持湿润。
2.将骨髓加入含有10%甘露糖的PBS中，制成单细胞悬浮液。
3.将单细胞悬浮液缓慢地加入L-精氨酸血红蛋白离心管中。
4.用Lymphoprep离心管离心，离心条件为800 g，20分钟，室温。
三、免疫细胞的分离1.离心完成后，可以看到在离心管中分层形成了三明显的界面。
上层是血浆，中层是淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，下层是红细胞。
2.使用移液管沿着离心管壁缓慢吸取中层的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，并将其转移至新的离心管中。
3.加入PBS冲洗淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，使之保持湿润。
4.用PBS洗涤细胞三次，以去除离心试剂和其他污染物。
5.将细胞转移到培养皿中，并采用适当的培养基进行培养和分离。
四、实验注意事项1.在进行分离实验时，应尽量避免产生气泡，以免对细胞的分离和纯度产生影响。
2.离心时，离心管应该尽量垂直摆放，避免出现倾斜，以免影响细胞的分层。
3.分层完成后，移液管在取出上层血浆时，应尽量避开中层的细胞，以免受到污染。
五、实验结果通过上述方法分离得到的小鼠骨髓中的免疫细胞，其纯度高，可以用于继续进行免疫学、细胞生物学方面的实验研究。
六、结论分离小鼠骨髓中的免疫细胞是一个重要的实验技术，可以为后续的免疫学研究提供重要的细胞材料。
在实际操作中，需要严格控制每一个步骤，以确保分离得到的免疫细胞的纯度和活力。
同时，也需要注意安全操作，避免对实验材料和人员产生伤害。
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
提取淋巴细胞实验报告
一、实验目的本实验旨在学习淋巴细胞提取的方法，掌握淋巴细胞的分离、纯化和计数技术，为后续的淋巴细胞功能研究奠定基础。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，主要存在于血液和淋巴组织中。
本实验采用Ficoll分离液法，根据不同细胞密度的差异，将淋巴细胞从其他细胞中分离出来。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠2. 仪器：离心机、移液器、加样器、离心管、无菌操作台、眼科剪、眼科镊、显微镜、计数板3. 试剂：Ficoll分离液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、淋巴细胞分离液、75%酒精、无菌生理盐水、10%甲醛固定液四、实验方法1. 小鼠免疫器官分离（1）将小鼠麻醉后，固定在手术台上；（2）用眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，暴露出腹腔；（3）用眼科镊取出小鼠的脾脏，放入装有PBS的无菌皿中；（4）用眼科剪将脾脏剪成小块，放入装有PBS的无菌皿中；（5）用无菌生理盐水冲洗脾脏，去除杂质；（6）将脾脏组织转移至新的无菌皿中，加入淋巴细胞分离液；（7）用移液器将淋巴细胞分离液和脾脏组织充分混合；（8）将混合液转移到离心管中，以1000rpm离心10分钟；（9）弃去上清液，保留沉淀物。
2. 淋巴细胞分离（1）将沉淀物加入适量的淋巴细胞分离液，轻轻混合；（2）将混合液转移到新的离心管中，以1000rpm离心10分钟；（3）弃去上清液，保留沉淀物。
3. 淋巴细胞计数（1）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（2）将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察；（3）按照计数板上的网格进行细胞计数。
4. 淋巴细胞纯度鉴定（1）将计数后的淋巴细胞加入适量的10%甲醛固定液，固定10分钟；（2）用PBS洗涤固定后的淋巴细胞，去除甲醛；（3）将淋巴细胞加入适量的细胞染色剂，染色30分钟；（4）用PBS洗涤染色后的淋巴细胞，去除染色剂；（5）将淋巴细胞转移到离心管中，以1000rpm离心5分钟；（6）弃去上清液，保留沉淀物；（7）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（8）用移液器将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察淋巴细胞形态，判断淋巴细胞纯度。
淋巴细胞分离的实验方法
肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。
2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。
3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。
4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。
5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。
6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。
7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。
2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。
4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。
5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。
2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。
2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
小鼠全身淋巴结的分布及摘出方法
小鼠全身淋巴结的分布及摘出方法淋巴结是末梢淋巴器官，是位于淋巴管通路上的淋巴过滤器官，可清除淋巴液中的异物、病菌和进行免疫反应。
它和脾脏一样，是与免疫反应，特别是与抗体的产生过程关系最密切的器官，作为与免疫反应有关的器官，此外还包括骨髓和胸腺，但从抗体产生的量来看，都远不及脾脏和淋巴结。
淋巴结中聚集着数种形态上可以区别的淋巴细胞。
处于免疫状态的动物的淋巴结内，大量的浆细胞聚集在一起，旺盛地产生抗体。
淋巴结就是这样在免疫过程中起着重要的作用。
实际上，在免疫学中，抗体产生过程的详细研究都是用取自脾脏及容易得到的淋巴结和淋巴结内的淋巴细胞进行的。
例如用取自脾脏和淋巴结的细泡悬浮液在体外检查抗体产生细胞，是免疫学研究中很重要而又容易进行的实验。
淋巴结的摘除，在技术上非常容易，关键在于要正确了解淋巴结的位置。
一、小鼠全身主要淋巴结的名称及分布小鼠淋巴系统特别发达，外来刺激可使淋巴系统增生。
因此易患淋巴系统疾病。
小鼠全身主要淋巴结有：前淋巴结、中淋巴结、深淋巴结、肩淋巴结、腰动脉淋巴结、腰淋巴结、腹股沟浅淋巴结、腹股沟深淋巴结、骼外淋巴结、骼内淋巴结等。
小鼠淋巴管的中缝，皮下的结缔组织中和肌肉之间，或者体腔内的内脏的附近都分布有淋巴结。
这些淋巴结中，位于皮下和肌肉的在体轴的左右两侧对称分布，附着于内脏的则沿体轴分布。
二、器材和动物准备1．器材摘出淋巴结手术需用小鼠解剖台，固定四肢用钉、尖圆手术剪、眼科尖头小剪、弯圆无钩眼科小镊、1ml注射器及5号针头、玻璃探针、生理盐水、棉球，如需要摘出淋巴结后观察动物变化，则还需要增加消毒和无菌操作基本器材，并需要在无菌操作下摘出淋巴结和缝合组织。
2．正常成年近交系或封闭群小鼠动物饲养环境对小鼠淋巴结的数量，大小和形态有一定影响，而且在不同的个体也有点差异，一般来说在不清洁的环境中饲养的动物，淋巴结较发达，所以，与无菌动物相比，普通动物的淋巴结较发达。
有人报告，小鼠淋巴结大小有品系差异，Albert和Johason(1962)研究了几个品系的淋巴结的大小(重量)，发现C3H的淋巴结最大。
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“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细
胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴
有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml
淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红
细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，
取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。