小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
外周血淋巴细胞分离方法
实验 18 外周血淋巴细胞分离方法目的了解密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理及其操作过程。
原理淋巴细胞分离掖是由60%的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。
它具有分子量大、无化学活性、20℃时比重为1.077士0.001的特性。
血液中各种细胞的比重不同，淋巴细胞与单核细胞的比重约为1.070，而粒细胞和红细胞的比重为1.092左右。
将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布，从而将淋巴细胞与其它血细胞分离开。
材料1. 淋巴细胞分离液(比重1.077土0.001)。
2. 肝素。
3. 无Ca2+、Mg2+的Hanks溶液，pH7.2～7.6。
4. RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)。
5. 其它:注射器、吸管、滴管（均为无菌）,血球计数板，水平离心机，显微镜等。
方法1. 无菌抽取静脉血2ml，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释，混匀。
2. 用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。
3. 经水平式离心2000r/min×20min，小心取出试管。
4. 用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500r/min ×10min。
5. 弃上清，加RPMI-1640培养液1ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。
（1）细胞计数: 取1滴细胞悬液置血球计数板上，静置片刻，显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数（见图15），按下列公式计算出细胞总数。
四个大方格细胞总数×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104细胞总数= 4（2）台盼蓝拒染法测定细胞活力: 取4份0.2%台盼蓝与1份4.25%生理盐水混合，将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合，在3分钟之内压片，在光学显微镜下计数未染色的细胞（为活细胞）与染色细胞（染成兰色,为死细胞），计算活细胞占细胞总数的百分数。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
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可重复滤过
超净台下操作全过程 4
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7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
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可重复滤过
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（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化徐太哲;李丽;王长山【摘要】目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验.方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率.结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85％,细胞获得率最高可达80％以上,活细胞百分率在92％以上.结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2016(039)004【总页数】3页(P10-11,13)【关键词】小鼠;Ficoll密度梯度离心;PBMC【作者】徐太哲;李丽;王长山【作者单位】佳木斯市红十字医院,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】R446.11+3外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。
研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll-hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离[1]。
离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。
PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCR等后续试验结果。
实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。
1.1 材料与分组BALB/c小鼠18只，5～6月龄，体重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。
报告实验二：淋巴细胞分离实验.ppt
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实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
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注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
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细胞计数
实验步骤 注意事项
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
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原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
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实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
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实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
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原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
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稀
释
外
周
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程及其影响因素。
实验过程中，将淋巴细胞与一种称为“共同诱导剂”的物质一起培养，观察其细胞增殖情况，并对其进行形态、生物学指标等方面的分析。
实验设备：1.淋巴细胞分离液2.共同诱导剂3.2.5％DMSO4.96孔板5.无菌蒸馏水6.比色计7.显微镜实验步骤：1.将新鲜小鼠脾脏切割成碎片，加入10ml的淋巴细胞分离液中，用离心机将其离心5min，取上清液为淋巴细胞。
2.将淋巴细胞洗涤三次，倒掉上清并加入10ml新的淋巴细胞分离液进行离心。
重复该步骤3次，以去除悬浮在淋巴细胞上的血红细胞和血小板。
3.将10μl细胞悬液加入90μl试验液（不含共同诱导剂），分别加入5% DMSO，共同诱导剂和一个对照组，分别孵育24h，48h和72h。
4.将80μl的淋巴细胞悬液加入新的96孔板中。
根据实验要求进行加药与相应的控制。
5.将淋巴细胞36h悬液转移到新的96孔板中，各包含80μl，进行形态学观察。
6.将淋巴细胞72h转移，在比色计中检测细胞增殖情况，计算得到相应的增殖指数（SI）。
实验结果：1.形态观察通过显微镜观察淋巴细胞的形态学变化。
对照组：淋巴细胞间距等距，无细胞破裂或缺损。
5% DMSO：淋巴细胞受到较严重的损伤，细胞全部变形。
共同诱导剂：淋巴细胞形态多样性，出现组织块状聚集现象。
2.细胞增殖情况70h后，比色计检测增殖情况。
对照组：SI为15% DMSO：SI为0.4共同诱导剂（分析不同剂量）：(a) 0.01ug/ml：SI为1.8(b) 0.1ug/ml：SI为2.7(c) 1.0ug/ml：SI为2.1实验分析：淋巴细胞转化是一种细胞增殖的过程，在此过程中细胞数量增加。
转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
体外诱导转化中，加入化合物或病毒等诱导剂，以刺激细胞增殖。
本实验中，采用的淋巴细胞采用体外诱导转化的形式。
实验结果表明，共同诱导剂对淋巴细胞转化具有明显的促进作用，而DMSO对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用。
小鼠淋巴细胞转化实验总结
小鼠淋巴细胞转化实验总结小鼠淋巴细胞转化实验总结引言：淋巴细胞转化实验是一项重要的实验技术，用于研究免疫系统的功能和细胞活性。
通过观察淋巴细胞在体外是否能够发生转化并增殖，我们可以评估免疫细胞的活性和对外部刺激的响应能力。
本文将对小鼠淋巴细胞转化实验进行总结，并对其进行分析和讨论。
1. 实验目的及原理淋巴细胞转化实验的目的是评估淋巴细胞在刺激下的增殖和分化能力，以便更好地理解其对外界刺激的免疫应答能力。
实验的原理基于一种特殊的细胞生长因子——白介素-2（IL-2）的作用。
IL-2对淋巴细胞起到促进增殖和活化的作用，因此通过观察淋巴细胞在IL-2作用下的生长情况，可以推测细胞对外部刺激的敏感性和响应能力。
2. 实验步骤及结果该实验可以分为以下几个步骤：1) 收集小鼠淋巴组织：选择适当的小鼠种类，例如BALB/c小鼠，通过剖腹取出小鼠的淋巴组织，如脾脏、淋巴结等。
2) 组织均质化：将收集到的淋巴组织进行细胞离心和均质化处理，以获得单细胞悬浮液。
3) 细胞计数和调整：使用显微镜和血球计数板对细胞进行计数，并根据需要调整细胞浓度。
4) 增殖实验：将细胞悬浮液分配到不同的培养皿中，并加入不同浓度的IL-2刺激因子。
分别设立对照组和实验组，观察细胞的生长情况，可使用细胞计数、MTT等方法评估增殖情况。
5) 分化实验：通过流式细胞术或荧光显微镜等方法观察细胞的分化情况，如淋巴细胞亚群的变化、细胞表面标记物的表达等。
根据实验结果，我们可以通过对细胞的增殖和分化情况进行定量和定性的分析。
实验组中，淋巴细胞在IL-2刺激下明显比对照组增殖更多，并且可观察到细胞表面标记物的变化，这表明外源刺激对淋巴细胞的活化和增殖具有显著的促进作用。
3. 深入讨论与理解小鼠淋巴细胞转化实验不仅可以评估免疫细胞的活性和对外部刺激的响应能力，还可以进一步研究不同免疫细胞亚群的功能差异和相互作用机制。
例如，我们可以通过添加特定的抑制剂或中和抗体来研究不同信号通路在细胞转化过程中的作用；也可以使用荧光标记和流式细胞术技术，对特定细胞亚群进行分离和分析，以深入揭示不同亚群在免疫应答中的功能和调控机制。
小鼠血液实验报告
一、实验目的1. 了解小鼠血液的基本组成和功能。
2. 掌握血液采集和分离的方法。
3. 学习血液细胞计数和生化指标检测的基本技术。
二、实验原理血液是人体和动物体内的重要液体组织，主要由血浆和血细胞组成。
血浆负责运输营养物质、激素、氧气和二氧化碳等，血细胞则负责免疫、凝血和氧气运输等功能。
本实验通过采集小鼠血液，分离血浆和血细胞，观察其形态和计数，以及检测生化指标，以了解小鼠血液的基本状况。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康雄性小鼠，体重20-25g。
2. 仪器：离心机、显微镜、血细胞计数板、生化分析仪等。
3. 试剂：抗凝剂、生理盐水、稀释液、染液等。
四、实验步骤1. 采集血液：将小鼠放入代谢笼，用脱脂棉蘸取酒精擦拭小鼠耳部，暴露耳静脉。
用注射针头插入耳静脉，抽取5mL血液，加入含有抗凝剂的试管中，混匀。
2. 分离血浆和血细胞：将血液样本置于离心机中，以3000r/min离心10分钟。
离心后，将上层血浆取出，下层血细胞沉淀置于另一个试管中。
3. 观察血细胞形态：取少量血细胞沉淀，加入染液，用显微镜观察血细胞形态，包括红细胞、白细胞和血小板。
4. 血细胞计数：将血细胞沉淀用稀释液稀释，用血细胞计数板计数红细胞、白细胞和血小板数量。
5. 生化指标检测：取少量血浆，用生化分析仪检测血糖、血脂、肝功能、肾功能等生化指标。
五、实验结果1. 血细胞形态：观察到的红细胞呈双凹圆盘状，白细胞有核，血小板呈不规则形状。
2. 血细胞计数：- 红细胞计数：5.0×10^6个/μL- 白细胞计数：1.0×10^4个/μL- 血小板计数：1.5×10^6个/μL3. 生化指标检测：- 血糖：4.5mmol/L- 血脂：正常- 肝功能：正常- 肾功能：正常六、实验讨论1. 实验结果表明，小鼠血液中红细胞、白细胞和血小板数量正常，说明小鼠血液处于健康状态。
2. 血细胞形态观察结果与理论相符，红细胞呈双凹圆盘状，白细胞有核，血小板呈不规则形状。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
淋巴细胞提取
淋巴细胞提取一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二实验对象：B／C 小鼠三实验器材：1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台四实验步骤：1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。
注意无菌操作。
3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。
用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。
（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。
离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。
倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
五、注意事项：①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。
覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。
否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。
其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
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*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
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小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
一、实验目的
1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理
2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础
二、实验材料
1.淋巴细胞分离液
2.EDTA抗凝剂
常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固
3.PBS缓冲液
PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用
4.戊巴比妥钠溶液
作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。
用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。
5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml）
三、实验原理
外周血中各种细胞的密度不同。
密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。
第一层为血浆层。
第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层
图1 小鼠外周血离心前后示意图
四、实验步骤
1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉
2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液
3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1)
4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面
5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管
6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min
7.弃上清液，加入4mlPBS待用
图2 第一次离心后图片
五、注意事项
1.EDTA和淋巴细胞分离液使用前应预温至22℃
2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在22~25℃，过低或过高应延长或缩短离心时间
六、实验思考
第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞，应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗
凝补充分的缘故。