外周血单个核细胞的分离(优质参考)
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。
）4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。
试验五人外周血单个核细胞的分离
免疫学实验免疫学研究所2006年8月目录基础实验部分第一部分非特异性免疫功能检测实验一巨噬细胞吞噬功能试验 (1)第二部分特异性体液免疫实验二抗体的常规检测 (3)实验三酶联免疫吸附实验（ELISA） (11)实验四体外抗体形成细胞的检测 (16)第三部分细胞免疫功能检测实验五人外周血单个核细胞的分离 (19)实验六E-玫瑰花环形成实验 (21)实验七淋巴细胞增殖实验 (22)第四部分免疫病理实验八豚鼠过敏实验 (26)第一部分非特异性免疫功能检测实验一巨噬细胞吞噬功能实验一、原理巨噬细胞（Macrophage,MΦ）作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。
能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。
MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。
在此，介绍两种小鼠腹腔M吞噬功能两种的方法：1．体内法：在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射白色念珠菌，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美兰染色，油镜下计数吞噬白色念珠菌的百分数，及观察MΦ内因被杀死而染为蓝色的白色念珠菌的形态、数目，以判断MΦ的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。
2．体外法：在体外将小鼠腹腔MΦ与白色念珠菌按比例混合，温育，以冷美兰染色，油镜下进行观察，观察指标同上。
二、实验材料1．动物：小白鼠（雌或雄，20～22g）。
2．白色念珠菌悬液：接种于沙氏培养基的白色念珠菌，28℃培养18～24h，生理盐水洗下，配成1×107个/ml细胞悬液。
3．无菌6%淀粉、无菌性注射器、针头、Hank’s液（含5%小牛血清）。
4．0.03%美兰（4℃存放）、华氏管、吸量管。
三、实验方法（一）体内法1．试验前3天，小白鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。
2．实验时，每只小鼠腹腔注射白色念珠菌菌液1ml，轻揉腹部，使菌液在腹腔中分布均匀，利于吞噬。
3．30分钟后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用接种环取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.03%冷美兰，盖上盖玻片。
外周血单个核细胞
步骤 2 – 洗涤PBMC
用毛细吸管仔细吸取第二层的单个核细胞（灰白色层）
将所得PBMC用洗液（RPMI-1640液或PBS）洗涤一次
2000rpm×10min
用1ml的RPMI-1640或PBS定容细胞，并混匀
步骤 3 –台盼蓝染色PBMC
用100μl加样器吸取已定容混匀的PBMC100μl与100μl的 2%台盼蓝染液混合 用100μl加样器吸取少许加入计数板下，计数
步骤 1 - 分离PBMC
采集静脉血约4ml，加入含0.1ml肝素溶液（125-250U/ml） 的抗凝管中，混匀
吸取2mlPBS置干净试管中，并与抗凝血混匀 吸取3ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，
将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入稀释的抗凝血
离心2000rpm×25min
密度梯度离心分离PBMC
外周血单个核细胞的分离
(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)
常用方法
聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)
分离液的密度是关键：1.077 PBMC包括淋巴细胞和单核细胞 血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红 细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC 密度稍低于分层液,• 故位于分层液界面上,这样就可获得 PBMC。
注：该步骤可省略，不染色而直接计数PBMC
步骤 4 –计数PBMC
1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数 2.计数原则：数上不数下，数左不数右。 3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细 胞总数 4.每ml健康成人血可分离出1×10 数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85 总数为： 87+79+91+85=342 一个大方格的平均数为：342/4=85.5 1ml液体中细胞量为：85.5×104 如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据 的2倍。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告引言外周血单个核细胞是指在外周血中富含的一类细胞，其细胞核不与胞质分离，与常见的多核细胞不同。
研究外周血单个核细胞的分离方法对于深入了解这一类特殊细胞的结构和功能具有重要意义。
本实验旨在探究一种高效、可靠的外周血单个核细胞分离方法。
材料与方法实验材料•鲜活外周血样本•离心管•PBS缓冲液•Ficoll介质实验步骤1.将外周血样本收集于离心管中。
2.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，使样本与缓冲液的比例为1:1。
3.用低速离心的方法，离心管在1000g条件下离心10分钟，以分离外周血细胞。
4.将上清液转移至新的离心管中，避免携带红细胞。
5.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，重新悬浮外周血细胞。
6.向离心管中加入Ficoll介质，使样本与介质的比例为1:2。
7.用高速离心的方法，离心管在2500g条件下离心15分钟，以分离外周血单个核细胞。
8.转移到新的离心管中，获取纯化的外周血单个核细胞。
结果与讨论实验结果通过以上实验步骤，我们成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
经过染色处理后，我们观察到这些细胞的细胞核形态正常，大小均一，未出现明显的核碎片。
这表明我们采用的分离方法在维持细胞完整性的同时有效地分离了外周血单个核细胞。
结果分析外周血单个核细胞的分离方法是一个关键的环节，本实验中采用的离心和Ficoll介质的组合分离方法是一种经典的操作流程。
离心的低速步骤旨在分离外周血中的核细胞和血小板，而高速离心则能够有效分离核细胞和红细胞等细胞成分。
Ficoll 介质则起到了调节比重、减缓细胞沉降速度的作用，从而实现了外周血单个核细胞的高效分离。
通过优化分离方法，我们能够获得更纯的外周血单个核细胞样本，为后续的实验研究提供可靠的基础。
同时，我们也可以通过进一步的实验，探究这些细胞的特性和功能，为相关疾病的研究提供重要的支持。
结论本实验采用离心和Ficoll介质的组合分离方法，成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
实验六_外周血单个核细胞的分离
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，yiye沿试管壁缓慢加入到 2ml分离液中
2000rpm，离心20min 小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)
正常范围:60-80%
X 100%
淋巴细胞转化实验
外周血涂片染色
形态学观察
计算转化率
弃上清，加入2ml Hank’s液
细胞计数
血加入到分离液的上层
离心后的单个核细胞层
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活.
• 应用水平离心机.
E-花环形成实验
SRBC
CD2
T
B
• 利用红细胞的吸附作用，以红细胞为指示细胞， 检测外周血中T细胞的数量以及所占比例的一种免 疫吸附实验。
实验六 细胞免疫功能检测
1.外周血单个核细胞的分离 2.E－花环形成实验 3.淋巴细胞转化实验
实验原理：
1.密度梯度离心法
外周血
淋巴细胞分离液
血浆层 淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
离心
分离液 (1.077±0.002g/l) 粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。
因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。
本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。
缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。
2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。
3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
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实验二十四外周血单个核细胞的分离
(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)
免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】
血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】
1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】
1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。
6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。
离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。
7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。
计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。
【结果判断】
【注意事项】
1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。
2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。
故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。
温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
3.分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。
离心速度在2000～2500r/min，离心时间为l5～20min，离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。
4.分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
5.将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。
6.充分冼涤分离后的单核细胞，可除去大部分混杂的血小板。
【应用与评价】
本方法操作简便、稳定。
细胞回收率达80%～90%，单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞活力可达95%以上。
但其中仍可混杂少量(约10%)其它细胞。
该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞(主要是淋巴细胞)悬液已能满足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。
故在细胞免疫试验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。
【思考题】
1.为何常用密度为1.077土0.001的分层液分离人单个核细胞？
2.利用密度梯度离心法分离人单个细胞，为何要将血液样品进行适当稀释，并要叠加于分层液上？
外周血单个核细胞的分离—密度梯度离心法
一、原理
根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。
利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。
已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在1.075~1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于1.090。
因此，若用比重为1.077±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。
二、器材与试剂
器材：
（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸
试剂：
（1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.077±0.001）（3）Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5%锥兰生理盐水溶液
三、操作步骤
在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。
将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20分钟。
用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血，计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细胞总数（/ml）。
离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图：
用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入刻度离心管内。
在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2次。
用0.5ml Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。
取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出白细胞总数（/ml）及单个核细胞数（/ml）。
检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单个核细胞中着色的死细胞数。
四、操作注意事项
注意分离液与稀释血的比例，一般以1:2~1:3为宜。
分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。
加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果。
做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。
五、实验结果记录与分析
通过前后两次细胞计数：
计算细胞回收率（%）
分离后单个核细胞总数×100%
分离前单个核细胞总数
计算单个核细胞纯度（%）
分离后单个核细胞总数×100%
分离后白细胞总数。