实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法哎呀，朋友们，今天咱们聊聊一个特别有意思的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
你可能会问，啥玩意儿？简单来说，就是从咱们的血液里找出一种特别的细胞。
想象一下，这就像在一个巨大的水果市场里，找出你最爱的苹果那样。
1. 什么是外周血单个核细胞？1.1 首先，得跟你解释一下这东西。
外周血单个核细胞，顾名思义，就是咱们血液里的一种细胞，单核的，也就是没有太多复杂的结构。
这些细胞可是咱们身体的宝贝儿，它们能做很多重要的工作，比如免疫应答啊、修复组织啊，所以咱们得小心翼翼地对待它们。
1.2 好了，听上去有点复杂，其实操作起来也没那么难。
咱们只需要用一些科学的工具和方法，就能把这些细胞从血液里分离出来。
这个过程不仅能帮助研究人员更好地了解身体的各种反应，还能在医学上发挥大作用呢。
2. 如何进行分离？2.1 让咱们来聊聊具体的操作步骤吧。
首先，得抽取血液。
哎，这步最让人感到心慌，想象一下那根针头，还是尽量别多想了。
不过别担心，这步过了之后，就进入了最有趣的环节——分离。
血液被抽出来之后，就像把你最喜欢的食材从锅里捞出来一样，要把那些外周血单个核细胞找出来。
2.2 这个过程主要用到的工具叫做离心机。
离心机就像一个超级旋转的机器，把血液转得飞快。
在这高速旋转的过程中，血液里的各种成分会被分离开来，就像咱们在清理菜市场时，把苹果和香蕉分开一样。
离心之后，血液中的细胞就会被分成几层，最上面一层就是咱们的目标——外周血单个核细胞。
2.3 之后，拿到这些细胞，就得用到一些特殊的试剂进行进一步处理。
想象一下，你拿到了一大袋苹果，接下来要把它们洗净、切片，这样才行。
细胞也是一样，需要经过处理和清洗，才能保证它们的纯净和活力。
3. 实际应用3.1 分离出来的外周血单个核细胞可是用途广泛。
比如说，它们在医学研究中，能帮助科学家们了解各种疾病的成因，还能用来开发新的治疗方法。
就像你买了一台新玩具，得先拆开看看里面的零件一样，这些细胞就是研究中的“零件”，帮助咱们了解身体的奥秘。
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)外周血单个核细胞外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：血细胞寿命1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。
红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。
白细胞的平均寿命很短，约7-14天。
粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。
在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。
素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。
淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。
T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告一、实验目的本实验旨在通过外周血单个核细胞分离实验，掌握外周血单个核细胞的分离方法及相关技术。
二、实验原理外周血单个核细胞分离是利用密度梯度离心法，将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来。
具体步骤如下：1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
由于不同种类细胞密度不同，在经过密度梯度离心后会形成不同层次的沉淀物。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
三、实验步骤1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
离心条件为2000rpm，20min。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
四、实验结果经过实验操作后，得到了外周血单个核细胞。
观察镜下可见细胞形态完整、染色质均匀分布、核仁清晰。
五、实验注意事项1. 实验前应认真阅读操作步骤和注意事项，并做好充分准备工作。
2. 操作过程中应保持无菌操作环境，并使用消毒好的器材和试剂。
3. 离心时应注意转速和时间的控制，以避免对细胞造成不必要的损伤。
4. 实验结束后应及时清理实验台和器材，并妥善处理实验废弃物。
六、实验总结本实验通过密度梯度离心法，成功地将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来，得到了单个核细胞。
在操作过程中，需要注意无菌操作环境和离心条件的控制。
通过本次实验，我们掌握了外周血单个核细胞的分离方法及相关技术，为后续的研究提供了基础。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法1. 引言大家好，今天咱们聊聊一个有点“高大上”的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
别担心，听起来复杂，但其实就像是把水果分开一样，方法有点多，但都不是很难。
首先，单个核细胞是什么呢？简单来说，它们是血液里的小战士，负责咱们身体的免疫系统工作。
而把这些小战士从血液中分离出来，是为了让我们能更好地研究它们，或者用于治疗各种病症。
现在，让我们一起来看看，这个过程到底怎么做吧！2. 准备工作2.1 收集血液样本首先，得从患者或志愿者那里收集血液。
想象一下，这就像是收集原材料一样。
我们一般用专门的血液收集管，这些管子里有点抗凝剂，防止血液在管子里凝固。
这个步骤就像是给血液穿上“防寒衣”，确保它们不会在实验室里冻住。
血液收集后，我们需要立即将其送到实验室，因为血液可不像冰淇淋那样能在冰箱里存放很久。
2.2 准备离心机接下来，我们用离心机来分离这些细胞。
离心机是一种可以快速旋转的机器，通过离心力把血液中的不同成分分开。
这个过程就像是在一个大旋转舞台上，血液里的各种“演员”根据他们的“舞姿”被分到不同的区域。
大家可以把离心机想象成一个超级有力的“旋转木马”，它能把血液中的细胞按类型分类开来。
3. 分离过程3.1 使用密度梯度离心法密度梯度离心法是我们分离单个核细胞的绝招之一。
我们在试管里加入一个特殊的液体，这个液体的密度不同层次逐渐增加，形成一个梯度。
然后把血液样本倒进去，接着用离心机旋转。
这就像是给试管里制造了一条“滑梯”，细胞们就沿着这个“滑梯”滑到它们各自的位置。
单个核细胞会在某一层次上停下来，其他细胞则会分布在不同的层次上。
3.2 清洗与收集当我们分离好细胞后，下一步就是清洗和收集。
用生理盐水或者其他洗涤液把细胞洗干净，去掉多余的杂质。
这个过程就像是给细胞洗个澡，确保它们干干净净，然后我们把这些清洗好的细胞取出来。
然后就可以把这些细胞用于各种研究或治疗了。
4. 结束语好了，今天的分享就到这里。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告引言外周血单个核细胞是指在外周血中富含的一类细胞，其细胞核不与胞质分离，与常见的多核细胞不同。
研究外周血单个核细胞的分离方法对于深入了解这一类特殊细胞的结构和功能具有重要意义。
本实验旨在探究一种高效、可靠的外周血单个核细胞分离方法。
材料与方法实验材料•鲜活外周血样本•离心管•PBS缓冲液•Ficoll介质实验步骤1.将外周血样本收集于离心管中。
2.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，使样本与缓冲液的比例为1:1。
3.用低速离心的方法，离心管在1000g条件下离心10分钟，以分离外周血细胞。
4.将上清液转移至新的离心管中，避免携带红细胞。
5.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，重新悬浮外周血细胞。
6.向离心管中加入Ficoll介质，使样本与介质的比例为1:2。
7.用高速离心的方法，离心管在2500g条件下离心15分钟，以分离外周血单个核细胞。
8.转移到新的离心管中，获取纯化的外周血单个核细胞。
结果与讨论实验结果通过以上实验步骤，我们成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
经过染色处理后，我们观察到这些细胞的细胞核形态正常，大小均一，未出现明显的核碎片。
这表明我们采用的分离方法在维持细胞完整性的同时有效地分离了外周血单个核细胞。
结果分析外周血单个核细胞的分离方法是一个关键的环节，本实验中采用的离心和Ficoll介质的组合分离方法是一种经典的操作流程。
离心的低速步骤旨在分离外周血中的核细胞和血小板，而高速离心则能够有效分离核细胞和红细胞等细胞成分。
Ficoll 介质则起到了调节比重、减缓细胞沉降速度的作用，从而实现了外周血单个核细胞的高效分离。
通过优化分离方法，我们能够获得更纯的外周血单个核细胞样本，为后续的实验研究提供可靠的基础。
同时，我们也可以通过进一步的实验，探究这些细胞的特性和功能，为相关疾病的研究提供重要的支持。
结论本实验采用离心和Ficoll介质的组合分离方法，成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
实验六_外周血单个核细胞的分离
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，yiye沿试管壁缓慢加入到 2ml分离液中
2000rpm，离心20min 小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)
正常范围:60-80%
X 100%
淋巴细胞转化实验
外周血涂片染色
形态学观察
计算转化率
弃上清，加入2ml Hank’s液
细胞计数
血加入到分离液的上层
离心后的单个核细胞层
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活.
• 应用水平离心机.
E-花环形成实验
SRBC
CD2
T
B
• 利用红细胞的吸附作用，以红细胞为指示细胞， 检测外周血中T细胞的数量以及所占比例的一种免 疫吸附实验。
实验六 细胞免疫功能检测
1.外周血单个核细胞的分离 2.E－花环形成实验 3.淋巴细胞转化实验
实验原理：
1.密度梯度离心法
外周血
淋巴细胞分离液
血浆层 淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
离心
分离液 (1.077±0.002g/l) 粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Isolation and storage of PBMC and viability test
实验原理
人 外 周 血 单 个 核 细 胞 （ peripheral blood mononuclear cell ， PBMC ）包括淋巴细胞 和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血 其他细胞不同。因此利用一种介于 1.0751.090 之 间 的 聚 蔗 糖 - 泛 影 葡 胺 （ ficollhypaque）分离液作密度梯度离心，离心后 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布 , 从而分离出PBMC。
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
肝素抗凝全血+等量Hanks液
将F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上 面。 应注意保持两界面清晰，勿使血 液混入分层液内。