人外周血单核细胞分离液使用说明
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
⑥加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
⑦加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
⑧细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
灏洋生物全血单个核细胞分离液说明书
www .tbdscience .com天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 本品只能用于科学研究，不能用于临床检测 天津灏洋华科生物科技有限公司 本品于GMP 标准下生产天津市灏洋生物制品科技有限责任公司◆TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD - 1 -天津滨海高新区华苑产业区（环外）海泰华科一路15号3幢5层技术服务T el: 158****1119 158****1119139****1119◆ QQ:2768676807 ◆E-mail:*********************灏洋生物 TBD sciences 人全血单个核细胞分离液说明书【包装规格】200ml/瓶【实验前准备】1. 适用仪器最大离心力可达1200g 的水平转子离心机2. 抗凝剂的选择在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝 剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验。
为此，天津灏洋特别开发出专利抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管 获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。
3. PBMC 高效离心管（详见PBMC 高效离心管使用说明）【检验方法】全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
首先根据样本量大小，分以下几种情况：一、 使用15ml 离心管时：情况A ：血液样本量小于3ml 时，实验方法如下：1. 取一支15ml 离心管，加入3ml 分离液。
2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，400-650g ，离心20-30min （注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。
第一层为血浆层。
第二层为环状乳白色单个核细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层。
人外周血流式细胞学分离单核细胞的方法
人外周血流式细胞学分离单核细胞的方法我折腾了好久人外周血流式细胞学分离单核细胞的方法，总算找到点门道。
咱就说刚开始的时候，我真是瞎摸索。
我知道有密度梯度离心这一步，但具体怎么操作完全没底。
我就按着人家书上说得大概做做看。
比如说，我拿了那个外周血样本，就跟捧着个宝贝似的，不敢乱动乱晃，因为觉得稍微有点差错可能就全完了。
第一次做的时候啊，那个离心的转速我就没设置对。
我就随便设了个看起来比较合理的值，可出来的结果那叫一个惨不忍睹，根本就没看到像样的单核细胞层。
当时我就懵了，这咋回事儿啊这是。
后来我就去查各种资料，发现转速这个事儿大有讲究。
就好比开车一样，快了慢了都不行，离心转速快了，细胞可能就被破坏了，慢了呢，各种细胞又分不开。
还有这个样本采集到开始离心的时间也很关键。
有一次我采集了样本之后，没有立刻处理，在旁边放了好一会儿才开始离心。
结果呢，细胞的状态就已经发生变化了。
那感觉就像你买了新鲜的水果想做水果沙拉，但是放了半天，水果都开始坏了，最后做出来的沙拉肯定也不好吃。
我就吃过这个亏，后来我采集了样本就麻溜儿地开始操作。
在密度梯度离心的时候呢，分层液的比例也很重要。
我试过不同的比例，乱调的时候基本就没有成功过。
正确的比例就像是魔法配方一样，稍微错一点都不行。
这个我是经过了好多好多的试验才确定下来，而且每次配分层液的时候我都小心翼翼的，跟做化学实验那种小心的程度差不多，各种量具都得洗干净，量要精确。
再就是收获单核细胞的时候，这个操作可得轻柔。
我有一回下手太重了，像个大老粗似的，那细胞估计都被我弄伤不少，在显微镜下一看啊，好多细胞都变形不成样子了。
所以在这个步骤上一定要耐心细致，就像从棉花堆里抽丝线一样，得缓缓地、轻轻地把单核细胞给分出来。
再说说洗涤细胞。
这个就像洗菜似的，你得把那些杂质什么的都给冲掉，但是又不能太用力，把菜都冲破了。
我以前洗涤细胞老不彻底，导致最后分析细胞的时候，总是有一些不明不白的东西干扰，背景不干净。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告一、实验目的本实验旨在通过外周血单个核细胞分离实验，掌握外周血单个核细胞的分离方法及相关技术。
二、实验原理外周血单个核细胞分离是利用密度梯度离心法，将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来。
具体步骤如下：1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
由于不同种类细胞密度不同，在经过密度梯度离心后会形成不同层次的沉淀物。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
三、实验步骤1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
离心条件为2000rpm，20min。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
四、实验结果经过实验操作后，得到了外周血单个核细胞。
观察镜下可见细胞形态完整、染色质均匀分布、核仁清晰。
五、实验注意事项1. 实验前应认真阅读操作步骤和注意事项，并做好充分准备工作。
2. 操作过程中应保持无菌操作环境，并使用消毒好的器材和试剂。
3. 离心时应注意转速和时间的控制，以避免对细胞造成不必要的损伤。
4. 实验结束后应及时清理实验台和器材，并妥善处理实验废弃物。
六、实验总结本实验通过密度梯度离心法，成功地将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来，得到了单个核细胞。
在操作过程中，需要注意无菌操作环境和离心条件的控制。
通过本次实验，我们掌握了外周血单个核细胞的分离方法及相关技术，为后续的研究提供了基础。
外周血单个核细胞分离的操作步骤！
外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！外周⾎单个核细胞分离的操作步骤！简介周⾎单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和⽐重与外周⾎其他细胞不同，红细胞和多核⽩细胞的⽐重在1.092左右，单个核细胞的⽐重为1.075-1.090，⾎⼩板为1.030-1.035。
因此利⽤⼀种介于1.075-1.092之间⽽近于等渗的溶液作密度梯度离⼼，使⼀定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种⾎细胞与单个核细胞分离。
分离⼀、基本原理⼆、试剂与器材1、聚蔗糖—泛影葡胺分层液，Hank’s液，RPMI-1640培养液，肝素。
2、⽔平离⼼机。
三、操作步骤1、取外周静脉⾎，⽤肝素抗凝，加等量的Hank’s液并混匀。
2、将分层液加⼊试管中，⽤量约为⾎量的1/2。
⽤吸管沿管壁缓缓将⾎加⼊分层液⾯上。
3、置于⽔平离⼼机离⼼，1500r/min，10min。
可见绝⼤多数单个核细胞悬浮于⾎浆和分层液的界⾯，呈⽩膜状。
4、⽤尖吸管吸取界⾯的细胞层，置于另⼀试管中，加⼊适量的Hank's液，混匀后以1000r/min，离⼼10min，弃上清。
5、同法洗涤细胞2次。
6、将细胞重悬于RPMI-1640培养液中，4保存备⽤。
四、注意事项1、在分离外周⾎单个核细胞过程中，将稀释⾎液加于分层液上时，要避免冲散分层液⾯，⽽要使之形成良好的界⾯，否则影响分离结果。
2、此法操作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率最重要的因素是分层液的⽐重。
淋巴细胞淋巴细胞来源于造⾎⼲细胞(hemopoietic stem cell，HSC)。
造⾎⼲细胞可分化成多能前体细胞( multipotent progenitor cell，MPC)，继⽽分化为淋巴样⼲细胞和髓样⼲细胞。
淋巴样⼲细胞可继续发育为成熟的T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。
⾻髓、胸腺造⾎微环境是造⾎⼲细胞分化发育的主要场所。
单个核细胞单个核细胞是⾎液⽩细胞中具有单个核细胞的⼀个含糊术语。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
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人外周血单核细胞分离液使用说明
产品内容：
试剂Ａ200mL
试剂D200mL
样本稀释液（赠品）200mL
清洗液（赠品）200mL
保存：18℃-25℃保存，有效期两年。
人外周血单核细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。
无菌条件下操作，启封后常温保存。
如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
操作步骤：
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况：
情况A:稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下：
1.取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。
如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A3ml、试剂D2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。
第一层为稀释液层。
第二层为透明试剂D液层。
第三层为环状乳白色单核细胞层。
第四层为透明试剂A液层。
第五层为红细胞层。
4.用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离
心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。
5.250g，离心10min。
6.弃上清。
7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。
8.250g，离心10min。
9.重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
10.差异贴壁法纯化细胞
（1）用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
（4）不贴壁的为淋巴细胞。
注：
a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。
b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。
如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。
情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下：
1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。
2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），
离心20-30min。
（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。
加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。
3.剩余步骤同“情况A”中步骤3至步骤10。
注意事项：
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
为获得最佳的实验结果，最好在取血2h内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。
血液放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.稀释后血液样本体积小于3ml时，试剂A和试剂D用量分别为2ml和1ml。
3.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
4.吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
5.吸取过多的单核细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。