提取外周血淋巴细胞
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。
下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。
- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。
- 为实验准备足够数量的外周血样本。
2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。
- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。
3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。
- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。
4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。
5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。
- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。
- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。
6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。
- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。
- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。
请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。
在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。
同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。
希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
PBMC提取
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。
其中淋巴细胞占很大一部分。
分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。
否则将分层混乱。
步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。
此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。
e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。
外周血细胞分离的方法有几种
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细
胞的重要来源。
其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。
自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞，下层主要为红细胞。
此方法简便但各层中
的细胞种类多，不纯。
血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和
少量红细胞。
下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞
形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。
其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水
浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两
者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。
此法分离的细胞纯度也不高。
氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。
淋巴细胞中混有的少
量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。
另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。
提取淋巴细胞流程
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。
但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。
[1]关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。
此方法取材方便，用血量少，操作简便。
1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。
在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。
所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。
有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。
“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。
[3]淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。
因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。
各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体无法进行的研究。
本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
详细的淋巴细胞的分离计数图文教程
注意事项
稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
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细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
用Hank’s液洗、离 心 (1000rpm，5min) 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与单 核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
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本实验：淋巴细胞
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实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
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实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
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实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×10 (稀释倍数）
2
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞百分率 =
活细胞数
细胞总数
.
× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
qPCR 样本处理(1)--------人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
人外周血淋巴细胞RNA的提取方法一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
取1.5ml 无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血T淋巴细胞提取是指从人体外周血样本中分离并纯
化T淋巴细胞的过程。
T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，具有调节免疫应答和击杀感染性病原体等功能。
通过对外周血中
T细胞的提取，可以进一步研究其功能和特性，并在免疫治疗、细胞治疗等领域应用。
人外周血T淋巴细胞提取的具体步骤包括：
1. 采集外周血样本：使用采血针或血管穿刺等方法从患者或捐赠者的外周血中取得样本。
2. 血液分离：采用离心等方法将血液分离为红细胞、白细胞和血浆等不同组分。
3. 白细胞富集：采用离心梯度离心或负选择等技术将白细胞富集到一定程度。
4. CD3阳性细胞筛选：使用单克隆抗体等与CD3表面分子结合，利用磁珠或荧光标记等方法对T细胞进行筛选，获得
CD3阳性的T细胞群体。
5. 细胞纯化：通过进一步的磁珠或荧光标记等技术，对T细
胞进行纯化，去除其他污染细胞，得到较纯的T细胞群体。
在人外周血T淋巴细胞提取的过程中，需要严格的操作和消
毒措施以确保样本的无菌和安全性。
此外，细胞提取后的T
细胞可以进一步用于细胞培养、分化、鉴定等实验操作，用于研究和治疗目的。
ELISPOT
ELISPOT检测HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞(PBMC)是否有候选肽特异性的T淋巴细胞，候选肽能否将它激活。
用ELISPOT检测活化T细胞分泌的IFN-r证实在正常人PBMC中是否有NY-BR-1特异性的CTL存在，同时也反应了各肽的免疫原性。
ELISPOT和51Cr杀伤实验检测表位肽的免疫原性结果显示HLA-A2阳性健康人外周血中有候选肽MLLQQNVDV(167～175)和NMWLQQQLV(1274～1282)特异性的前体细胞。
1．什么是ELISPOT检测?答:酶联免疫斑点( enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。
淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。
这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。
将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。
然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。
最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。
每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。
实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。
该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。
第二部分：关于ELISPOT试验技术中对细胞的处理1．提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？答：如果取外周血淋巴细胞(PBMC) 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。
在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。
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/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞
分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。
现在大多数用的密度梯度离心法。
一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。
现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。
我的经验
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分
温度20c －28c
时间：20分钟
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)
5。
取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。
还有办法的。
8 离心。
转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)
时间：10分钟
温度：4c
9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）
10.细胞计数＋洗涤细胞。
刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。
这样是不是很节省时间？？
11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。
总共数4大正方形
d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。
加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱.
看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！
1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是
2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的
3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团
建议;
不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。
所以第一步离心的转速也会有所不同。
最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
我用的是eppendorf离心机，上海xx所的淋巴细胞分离液（名字忘记了）效果比较好。
不推荐使用北京夏斯的细胞分离液，连个说明书都没有，而且分离得到的细胞中，血小板会很多.
非常感谢主任的建议，但是小弟这样做证明
利用离心是可以把细胞与分离液体分开的。
我也培养结核杆菌，它门就是漂浮在培养液的上面，膜状生长，但是我通过离心，就能把细菌集结到管底，当然这就需要很高的转速和较长的时间。
实践证明我这样做是有用的。
还有个明显的证明就是，你把第一步离心的速度加大试试看，到2500以上，可能所有的pbmc 都会沉到分离液的下面。
至于吸取血浆，我是这样考虑的：少吸取一点，不要为了吸取血浆把层次搞乱了。
这样吸血浆内就不会混有pbmc。
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视频:/bbs/topic/23641434?keywords=外周血淋巴细胞分离
zhengsg2000战友您好，淋巴细胞分离做的多了，也积累了一点经验和教训，谈谈我的想法。
我不明白您为什么要PBS稀释，我觉得没必要。
肝素抗凝后可以直接分离。
还有，您分离中我发现是标本多分离液少，我觉得正好反了，淋巴细胞分离最好标本量≤分离液的量。
2000r离心时间10分钟足够了，dongwp战友说的很对，如果吸出过多分离液，相对要多加PBS，混匀后二次离心，其实没有必要吸那么多分离液，离心后，中间层可见明显的灰白色的淋巴细胞层，只把它吸出来就可以了。
淋巴细胞分离的方法操作并不是那么严格，每个人的操作条件可能不一样，达到目的就可以了。
这种分离方法，不可能把单核细胞和淋巴细胞分离开的。