细胞原代培养之外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
细胞原代培养之外周血淋巴细胞培养
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外周血淋巴细胞的培养 淋巴细胞的培养 (Lymphoc浮细胞的培养方法 悬浮细胞的形态特征观察
实验原理
外周血淋巴细胞表面有丝分裂原受 当在培养液中加入丝裂原PHA PHA时 体,当在培养液中加入丝裂原PHA时, 可与淋巴细胞表面的相应受体结合 使其活化增殖. 使其活化增殖.
实验步骤( 实验步骤(4)洗剂淋巴细胞
D'Hanks液4 ml 4 ml洗一次 1640完全培养液4 ml 4 ml洗一次 每次1000rpm离心5 min,弃大部分上清, 约留1ml计数.
实验步骤(5)细胞计数 用血细胞计数板计数. 一般计数四周大方格 四周大方格内细 四周大方格 胞,密度计算公式为: 细胞密度(个/ml)=(4 大方格细胞总数 /4)×10000×稀释倍数
实验材料
骨髓细胞:来自小鼠股骨
设备及主要用品
1, 纯水制备设备 2, 电热干燥箱 3, 高压蒸汽消毒锅 4, 离心机 5, 超净台 CO2 6, CO2培养箱 过滤器及0 22 7, 过滤器及0.22m滤膜 8, 血球计数板 9,培养瓶或培养皿
实验试剂
(1)RPMI 1640 基础培养液 )
(2) 小牛血清(灭活) ) 小牛血清(灭活) (3) 青,链霉素 ) (4) PHA(2 mg/ml) ) ( ) (5) Hank's液 ) 液 (6) 5%NaHCO3 ) % (7) 75%酒精棉球 ) %
(2)获取骨髓细胞
1)断颈处死小鼠,浸泡在75%乙醇中3-5min. 2)剪切后肢,去掉肌肉,剥出股骨放入2%柠檬酸钠溶液 中,剪刀剪开两端,用注射器吸取溶液吹打将骨髓细 胞冲出,直至骨髓腔呈白色,将骨髓细胞溶液1000rpm 离心10min. 3)弃上清,将细胞重悬于2mlHanks液.
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 6学时一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液(一般是0.075mol/L的KCl)处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA(植物血球凝集素)或ConA 等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
向标本。
三、仪器设备显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。
四、相关知识点(一)细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。
2、无菌操作的要领和要求1)培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。
2)超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。
为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。
3)洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。
4)火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。
淋巴细胞培养方法
淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，对于研究免疫学以及治疗免疫相关疾病具有重要意义。
淋巴细胞的培养是研究淋巴细胞功能和特性的关键步骤。
本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，以帮助读者了解淋巴细胞培养的基本原理和操作步骤。
一、材料准备1. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。
2. 补充物：培养基中常需添加胎牛血清(FBS)、人血清(HS)等，以提供细胞所需的营养和生长因子。
3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，以防止细菌污染。
4. 受试者淋巴细胞：可以通过外周血或淋巴组织等方式获取。
二、淋巴细胞的分离1. 密度梯度离心法：将受试者淋巴细胞与离心管中的淋巴细胞分离液缓慢加入离心管中，离心分离液的密度逐渐由低到高，使淋巴细胞在不同密度的离心分离液之间分层离心。
离心后，淋巴细胞会沉积在特定密度的离心分离液上，可将淋巴细胞分离出来。
2. 磁珠分离法：利用表面标记有特定抗体的磁珠与淋巴细胞表面的特异抗原结合，通过磁场将目标淋巴细胞与其他细胞分离。
三、淋巴细胞的培养1. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪准确计算淋巴细胞的数量。
2. 细胞密度调整：根据实验需求，将细胞悬浮液中的淋巴细胞浓度调整至适当的浓度，通常为1-2 × 10^6个细胞/mL。
3. 培养基配制：根据实验需要，将培养基加热至37℃后，加入适量的补充物和抗生素，混匀均衡。
4. 细胞培养：将细胞悬浮液与预先配制好的培养基按照适当的比例混合，转移到细胞培养瓶或培养皿中。
5. 培养条件：将细胞培养瓶或培养皿置于37℃恒温培养箱中，设置适当的CO2浓度和湿度，通常为5% CO2和95%湿度。
定期观察细胞形态和生长情况。
6. 培养周期：根据实验需求，定期更换新鲜的培养基，一般为2-3天一次，以保证细胞的正常生长和代谢。
四、细胞活性检测1. 活细胞计数：使用染色剂如Trypan blue染色，观察染色细胞和未染色细胞的比例，以评估细胞的存活率。
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析一、实验目的（1）、熟悉淋巴细胞体外培养原理。
（2）、掌握人体微量血液体外培养技术。
（3）、通过本次实验掌握制备染色体标本的方法。
（4）、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
（5）、培养学生的自主能力，锻炼学生的动手操作能力。
二、实验原理外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G1期（或Go期）一般情况下是不再分裂的在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养秋水仙素的处理低渗和固定就可获得大量的有丝分裂细胞。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
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04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
[3]人外周血淋巴细胞培养
![[3]人外周血淋巴细胞培养](https://img.taocdn.com/s3/m/58284eeeaeaad1f346933ffe.png)
染色体标本制作
7 再固定 加入新配置的固定液5ml固定,用吸管将底部沉淀物轻轻打匀, 再继续室温下固定25分钟. 8 离心 以1500rmp 离心8分钟,弃去上清液,保留沉淀物. 9 制片 加入新配置的固定液0.5-1ml,用吸管将底部沉淀打匀制成细胞 悬液.用吸管吸细胞悬液1-2滴,从高处(约1-1.5m)滴在用冰 酒精浸泡过的洁净载波片(用酒精的原因是使玻片在晾干过程中依 旧保持低温)上.立即用口吹散(吹气方向和玻片成直角).并在 酒精灯的火焰下快速通过几次,促使细胞平铺于载波片上并在空气 中晾干. 10 染色 用稀释的Giemsa染液染色30分钟,用水轻轻洗去染液晾干后即 可镜检.
染色体标本制作
1 离心 将培养物用吸管完全移入刻度离心管内(两瓶培养物转移到一个离心管中),以 1500rpm离心8分钟,吸管小心吸去上清液,留底层离心沉淀物. 2 低渗处理 加7ml预热到37 ℃ 的0.075mol/L KCl液,用吸管打匀(吹打:先将胶头中空气排空, 再在液面下,用吸管吸取少量液体,再吹出,以达到搅动液体使液体中物质均匀分散 开的目的,吹打动作一定要轻且快,避免动作剧烈引起细胞破碎),保持在37℃水浴 中低渗处理20分钟. 3 预固定 经低渗20分钟后,加固定剂(甲醇:冰乙酸=3:1)1ml立刻吹打匀.(注意:固 定剂需要现配现用) 4 离心 为收集细胞,以1500rpm离心8分钟,弃去上清液保留沉淀物 5 固定 沿离心管壁加入新配置的固定液5ml固定用吸管将底部沉淀物轻轻打匀(加入固定 液后要立刻吹打,且尽量吹打均匀,避免细胞团被固定在一起),再继续室温下固定 30分钟. 6 离心 以1500rpm离心8分钟,弃去上清液,保留沉淀物.
试验步骤
(一)人外周血淋巴细胞培养
1 将无菌室紫外线灯开放1～2H,洗净双手,穿上无菌衣,进入无菌室, 关闭超净工作台上的紫外线灯.用75%酒精擦洗手和各种试剂瓶,然后将 RPMI-1640培养液,小牛血清,双抗(青,链霉素),PHA等移入超净工作 台上. 2 按微生物接种操作方法,时时经酒精灯火焰灭菌配好培养基.其组分如 下: RPMI 1640:4ml PHA:0.5ml 小牛血清:1ml 双抗:0.05ml 在上述培养基中加入0.4-0.5ml的全血,盖上瓶塞,轻轻摇均.放置37℃温 箱中培养72小时—这个时间恰好是白细胞分裂的两个周期 3 秋水仙素处理 终止前4小时,加入一滴秋水仙素液(终浓度:100微克/毫升).摇均, 放回Lv, Xinhuai
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(6)稀释培养
终浓度:5× 105 个/ml 每培养瓶分装量:5 ml 置37CO2培养箱中培养.
结果观察
培养3天后观察结果. 1,直接观察:观查淋巴细胞密度是否增 加,是否有正在分裂的细胞? 2, 计数
实验报告
1.简述体外培养悬浮细胞的形态特征. 1.简述体外培养悬浮细胞的形态特征. 简述体外培养悬浮细胞的形态特征
培养前后观察淋巴细胞悬液有何不同? 2. 培养前后观察淋巴细胞悬液有何不同? 实验注意问题? 3. 实验注意问题?
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(2)获取骨髓细胞
1)断颈处死小鼠,浸泡在75%乙醇中3-5min. 2)剪切后肢,去掉肌肉,剥出股骨放入2%柠檬酸钠溶液 中,剪刀剪开两端,用注射器吸取溶液吹打将骨髓细 胞冲出,直至骨髓腔呈白色,将骨髓细胞溶液1000rpm 离心10min. 3)弃上清,将细胞重悬于2mlHanks液.
实验步骤(3)分离淋巴细胞 用淋巴细胞分离液 淋巴细胞分离液分离淋巴 淋巴细胞分离液 细胞. 分离方法: 1,先在带盖离心管中加入2 ml淋巴细胞分离液,再沿管 壁缓慢 缓慢加入2ml骨髓细胞, 缓慢 注意不要破坏两液交界面的 液面. 2 , 2000rpm 离 心 2 0 min, 两 液交界面的白色薄层即为淋 巴细胞.吸出转入另一离心 管.
实验步骤
配培养液: (1) 配培养液:完全培养液组成
1640基础培养液 RPMI 1640基础培养液 小牛血清 肝素( IU/ml) 肝素(180 IU/ml) PHA( ml) PHA(2 mg/ ml) 青,链霉素 90% 90% 10% 10% 3.6 IU/ml 40 g/ml 100 IU/ml 100 g/ml pH至6.8-7.2, 滤膜过滤除菌. 调pH至6.8-7.2,0.22 m滤膜过滤除菌.
外周血淋巴细胞的培养 淋巴细胞的培养 (Lymphocyte culture)
实验目的
学习悬浮细胞的培养方法 悬浮细胞的形态特征观察
实验原理
外周血淋巴细胞表面有丝分裂原受 当在培养液中加入丝裂原PHA PHA时 体,当在培养液中加入丝裂原PHA时, 可与淋巴细胞表面的相应受体结合 使其活化增殖. 使其活化增殖.
实验材料
骨髓细胞:来自小鼠股骨
设备及主要用品
1, 纯水制备设备 2, 电热干燥箱 3, 高压蒸汽消毒锅 4, 离心机 5, 超净台 CO2 6, CO2培养箱 过滤器及0 22 7, 过滤器及0.22m滤膜 8, 血基础培养液 )
(2) 小牛血清(灭活) ) 小牛血清(灭活) (3) 青,链霉素 ) (4) PHA(2 mg/ml) ) ( ) (5) Hank's液 ) 液 (6) 5%NaHCO3 ) % (7) 75%酒精棉球 ) %
实验步骤( 实验步骤(4)洗剂淋巴细胞
D'Hanks液4 ml 4 ml洗一次 1640完全培养液4 ml 4 ml洗一次 每次1000rpm离心5 min,弃大部分上清, 约留1ml计数.
实验步骤(5)细胞计数 用血细胞计数板计数. 一般计数四周大方格 四周大方格内细 四周大方格 胞,密度计算公式为: 细胞密度(个/ml)=(4 大方格细胞总数 /4)×10000×稀释倍数
计数注意
计数板及盖玻片应彻底用酒精棉球擦洗干净. 注意方法:加样时要先盖好盖玻片,再加样品. 用细口滴管将细胞悬液由盖玻片边缘滴一小滴 (不宜过多),让悬液沿缝隙靠毛细渗透作用 自行进入计数室.(或用10l的加样枪缓慢从 盖玻片边缘加样,直到悬液到达计数室另一 边.) 计数原则:对压线细胞,计左不计右,计上不 计下.