淋巴细胞培养
人外周血培养实验报告
1. 掌握人外周血淋巴细胞体外培养技术。
2. 学习制备染色体标本并进行核型分析。
3. 了解淋巴细胞有丝分裂过程及其影响因素。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，在免疫应答和维持内环境稳定中起关键作用。
在体外培养条件下，淋巴细胞受到植物血球凝集素（PHA）的刺激，可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂周期。
通过秋水仙素处理，使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：PHA、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、肝素、双抗等3. 仪器：显微镜、培养箱、吸管、培养瓶、载玻片、酒精灯、碘酒、无菌棉签等四、实验方法1. 采样：无菌条件下，取小鼠外周血0.5-1ml。
2. 培养液配制：无菌条件下，按照比例配制PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、PHA、肝素、双抗等。
3. 细胞培养：将外周血加入培养瓶中，每瓶加20滴左右，轻摇均匀。
将培养瓶置于36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时轻摇1次。
4. 秋水仙素处理：在培养72小时后，加入适量秋水仙素，使细胞分裂停滞在中期。
5. 细胞收获：收获细胞，进行低渗处理，使细胞膜破裂，染色体释放。
6. 固定：将低渗处理后的细胞加入甲醇和冰醋酸的混合液中固定。
7. 染色：将固定后的细胞涂片，进行染色。
8. 显微镜观察：在显微镜下观察染色体形态，进行核型分析。
1. 细胞培养：在培养过程中，细胞逐渐增多，形成细胞群体。
2. 秋水仙素处理：细胞分裂停滞在中期，染色体形态清晰。
3. 显微镜观察：观察到人类染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。
六、实验讨论1. 外周血淋巴细胞培养的成功与否，取决于培养液的成分和培养条件。
本实验采用PRMI 1640或M199培养基，并加入适量小牛血清、PHA、肝素、双抗等，保证了细胞的正常生长。
2. 秋水仙素处理是本实验的关键步骤。
适量的秋水仙素可以使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
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04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
人外周血淋巴细胞培养
通过人外周血淋巴细胞培养，可以研究疾病的预 防策略，如利用疫苗进行预防接种等。3Fra bibliotek个体化医疗
利用人外周血淋巴细胞培养，可以开展个体化医 疗研究，根据患者的免疫状况制定个性化的治疗 方案。
05
结论
研究成果总结
01
成功建立了人外周血淋巴细胞的培养方法，并观察到了淋巴细胞的生 长和增殖过程。
02
细胞活性检测
使用台盼蓝染色等方法检测细胞的活性。
培养基检测
定期检测培养基的pH值和营养物质浓度， 确保培养条件适宜。
04
人外周血淋巴细胞培养的 应用和前景
在免疫学研究中的应用
免疫应答机制研究
通过人外周血淋巴细胞培养，可以深入了解免疫应答的机 制，包括抗原识别、信号转导、细胞活化等过程。
免疫细胞功能分析
淋巴细胞分为T细胞、B细胞和NK细胞等多种类型，每种细胞类型具有不同的功能和 特点。
淋巴细胞在人体健康和疾病发生中起着至关重要的作用，因此研究淋巴细胞对于了 解疾病机制和开发治疗手段具有重要意义。
淋巴细胞培养技术
淋巴细胞分离技术
淋巴细胞功能检测方法
通过密度梯度离心法和免疫磁珠分离 法等手段从外周血中分离出淋巴细胞。
疫苗免疫原性研究
通过培养的人外周血淋巴细胞，可以研究疫苗对免疫系统的刺激作 用，评估疫苗的免疫原性。
疫苗效果评估
利用人外周血淋巴细胞培养，可以对疫苗进行效果评估，包括疫苗 的保护率、免疫持久性以及对不同人群的适应性等。
在疾病治疗和预防中的应用前景
1 2
疾病治疗
利用人外周血淋巴细胞培养，可以为某些疾病的 治疗提供支持，如肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾 病治疗等。
研究意义
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
淋巴细胞分离与培养
• （2）培养空间 • 培养液与液面上的空间二者的体积比例 一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好 维持在2～5mm 的范围,以便于气体交 换。 • （3）恒温培养箱 • 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。
• 5、常见失败原因 • (1) 污染 • 污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括 细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。 支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响 较小,尤其只培养72 小时。一般是分离 过程中的用液和培养基出现了污染。
• EB病毒可有效地转化外周血B淋巴细胞, 建立永生的淋巴母细胞系,可永久保存宝 贵的病例材料。世界上许多遗传研究中 心都用此方法处理每一份血标本，在液 氮中冻存转化后的淋巴细胞。这样就可 以无限期地保存、复苏和增殖病人体细 胞样本，建立人类遗传种质库
• 淋巴细胞是EBV的天然宿主，EBV对B 细胞有天然的亲和力并可使其发生转化 并增殖。与通常在体外使用的B细胞活化 剂引起的B细胞的暂时的一过性分裂不同， EBV转化的淋巴细胞是一种非裂解型细 胞：病毒感染后不能在细胞体内复制后 代，但能整合在宿主细胞基因组上，一 部分整合了病毒基因组的细胞发生转化
• （2）血样本的采集：先以碘酒和75%乙 醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约 0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血 1ml。转动针筒以混匀肝素 • （3）接种：常规消毒后，立即将针头插入 灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁 将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养 瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾 斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以 混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温 箱内静置培养72h。
• 2、方法 • (1)．采静脉血2ml 加入肝素抗凝管 • (2)．用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用 玻璃棒），2000rPm 离心20 分钟，用毛 细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中， 于4℃冰箱保存备用，
淋巴细胞增殖实验细胞形态法
淋巴细胞增殖实验细胞形态法
淋巴细胞增殖实验是一种常用的细胞生物学实验方法，用于研究淋巴细胞的增殖能力。
其中，细胞形态法是一种直接观察和描述细胞形态变化的方法。
下面是该实验的步骤：
1. 细胞准备：收集需要进行实验的淋巴细胞，并将其分散在培养基中。
2. 细胞培养：将淋巴细胞悬浮液加入培养皿中，放置在恒温培养箱中，使其在适宜的温度、湿度和氧气条件下培养。
3. 处理因子添加：根据实验设计的要求，可以在培养期间添加不同的诱导因子或抑制因子，以刺激或抑制淋巴细胞的增殖。
4. 细胞观察：在特定时间点（例如24小时、48小时等）取出培养皿中的细胞，使用显微镜观察细胞形态的变化。
5. 形态描述：通过观察细胞的大小、形状、颜色、胞质和核的结构等特征，描述细胞在不同处理条件下的形态变
化。
6. 数据分析：根据形态观察结果，结合其他实验数据（如细胞计数、代谢活性等），进行统计分析和结果解释。
通过淋巴细胞增殖实验细胞形态法，可以评估淋巴细胞的增殖能力，并揭示不同因子对细胞形态的影响，有助于进一步研究淋巴细胞的生物学特性和相关疾病的发生机制。
淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨
・诊断技术・淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨遵义医学院附属医院肾病风湿科(563003) 刘春梅 赵士启 张克非 陈忠霞 刘 永 淋巴细胞培养是实验研究常用的一项技术,对于培养器皿,可以选用培养板,培养瓶,培养皿,三角烧瓶,试管,青、链霉素小瓶等[1,2]。
目前,关于淋巴细胞分离方法的文献资料较多,论述较详细,而对淋巴细胞培养则论述较少,较简单。
细胞培养工作十分繁琐,环节较多,探讨细胞培养的条件,对于成功培养细胞具有十分重要的意义。
本文选用1.5ml离心管培养淋巴细胞,观察了淋巴细胞培养前后的变化,探讨了淋巴细胞培养的条件及失败的常见原因。
现报道如下。
1 材料与方法1.1 主要材料和设备 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂):RPMI1640培养液(G ibco,华美生物工程公司进口分装);血清(各实验对象的自身血清);肝素溶液(250U/m1),D’—Hanks液,lm ol/L盐酸,516%氢氧化钠溶液,2%台盼蓝染液,均为本实验室自配; pH试纸(上海三爱思试剂有限公司);1.5ml离心管(Axygen);10ml、15ml、50ml刻度离心管;毛细吸管;移液枪,1～200μl、1000μlT ip(枪头);洁净工作台(月坛牌,北京冠鹏净化设备有限公司);HC—TPⅡ-5架盘药物天平(上海第二天平仪器厂);水平式低速离心机(北京医用离心机厂);kx—21N血细胞自动分析仪(Sysmex,日本):O LY MPUS倒置显微镜;Shel LABC O2恒温培养箱(37℃,5%C O2)(Shelton manufac2 turing,inc,US A);BC D—218冰箱(澳柯玛);202-2型电热恒温干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。
1.2 研究对象 为2003年3～8月住本院肾内科的部分病人。
其中,原发性肾病综合征患者18例(男10例,女8例),年龄15～53岁(平均31.28±11.83岁);慢性肾小球肾炎患者11例(男8例,女3例),年龄18～49岁(平均38.00±8.83岁)。
淋巴细胞培养方法
淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是机体中重要的免疫细胞，其培养方法对于研究免疫功能、疾病发生机制以及药物筛选具有重要意义。
本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，帮助研究者进行淋巴细胞的体外培养。
一、材料和试剂准备1. 血液样品：采集新鲜、无菌的血液样品，尽量避免使用已保存的血液。
2. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。
3. 补充物：培养基中可添加的补充物包括胎牛血清(FBS)、人血清(HS)、重组细胞因子等。
4. 抗生素：培养过程中可添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素等，以抑制细菌和真菌的污染。
二、淋巴细胞分离1. 密度梯度离心法：将新鲜血液样品稀释后，加入离心管中，缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，离心后淋巴细胞会沉积在离心管底部，可用无菌移液器吸取上清液。
2. 磁珠分离法：利用磁珠表面特异性抗体与淋巴细胞表面标志物结合，通过磁力将淋巴细胞与其他细胞分离。
三、淋巴细胞培养1. 细胞计数和调整：将分离得到的淋巴细胞进行细胞计数，根据需要调整细胞密度，通常为1-2×10^6个细胞/mL。
2. 培养基配置：根据实验需要配置相应的培养基，通常包括培养基、补充物和抗生素。
3. 培养条件：将淋巴细胞悬浮液均匀地加入含有培养基的培养皿中，置于37℃恒温培养箱中，通常采用5% CO2气氛。
4. 细胞增殖：培养过程中，淋巴细胞会进行增殖，可根据需要进行细胞传代。
5. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养液，以保持培养环境的稳定。
6. 实验操作：在培养过程中，可根据具体实验需要进行细胞刺激、药物处理等，以模拟体内环境或研究特定的生物学功能。
四、细胞检测和分析1. 细胞活力检测：使用细胞活力试剂盒等方法，对培养的淋巴细胞进行细胞活力检测，评估其生存状态和增殖情况。
2. 免疫分析：可使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等方法，对培养的淋巴细胞进行免疫表型分析、细胞因子检测等。
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淋巴细胞培养
一、严格无菌操作
对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。
无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。
二、培养器皿的选择
淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。
有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml 离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0. 05) 。
用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。
可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点: (1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。
更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。
我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。
青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。
(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。
对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。
而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。
而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。
三、血清的选择
淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。
但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。
血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。
四、pH 值
细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长。
RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。
五、培养空间
培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换。
六、恒温培养箱
温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。
七、常见失败原因
1.污染
污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。
支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72 小时。
一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。
2.pH 值过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。
3.诱导剂淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS) 、白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。
须注意它们的浓度及是否失效。
4.培养器皿洗涤不干净有蜡、油污或酸残留。
5.培养用液含有杂质配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe 、Ca等离子及杂质,可影响细胞的增殖。
6.接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞。
7.血清质量不佳。
8.恒温培养箱的CO2 、温度等不稳定。
9.存在个体差异在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。