人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
离心管号
秋水仙素
ug/ml
1（和3对照） 2（和3对照） 3
0.5(1-3h) 1(6-8h) 1(6-8h)
4（书）
1(6-8h)
低渗液ml 预固定ml 固定ml
1+7(20min) 1+7(35min) 1+7(20min) 1+7(20min) 0.5（2min) 5(15min) 0.5(2min) 5(15min) 0.5(2min) 5(15min) 2-3滴(2min) 3(10min)
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
绝对长度/mm 相对长度 短臂/mm 长臂/mm 臂比 着丝粒指数 随体 24.0 0.0778 12.0 12.0 1.0000 0.5000 22.0 0.0713 6.0 16.0 2.6667 0.2727 20.0 0.0648 9.5 10.5 1.1053 0.4750 19.0 0.0616 7.0 12.0 1.7143 0.3684 16.5 0.0535 6.0 10.5 1.7500 0.3636 16.0 0.0519 4.5 11.5 2.5556 0.2813 16.0 0.0519 6.0 10.0 1.6667 0.3750 14.5 0.0470 4.5 10.0 2.2222 0.3103 13.5 0.0438 5.0 8.5 1.7000 0.3704 13.5 0.0438 4.0 9.5 2.3750 0.2963 12.5 0.0405 4.0 8.5 2.1250 0.3200 12.5 0.0405 5.0 7.5 1.5000 0.4000 10.0 0.0324 4.0 6.0 1.5000 0.4000 10.0 0.0324 5.0 5.0 1.0000 0.5000 9.0 0.0292 0.0 9.0 #DIV/0! 0.0000 9.0 0.0292 2.5 6.5 2.6000 0.2778 8.5 0.0276 3.5 5.0 1.4286 0.4118 8.0 0.0259 2.0 6.0 3.0000 0.2500 8.0 0.0259 3.5 4.5 1.2857 0.4375 7.0 0.0227 3.0 4.0 1.3333 0.4286 6.0 0.0194 2.0 4.0 2.0000 0.3333 6.0 0.0194 0.0 6.0 #DIV/0! 0.0000 27.0 0.0875 11.0 16.0 1.4545 0.4074 6.0 0.0194 2.0 4.0 2.0000 0.3333
外周血细胞染色体培养操作
外周血细胞染色体培养操作实验六人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验目的1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。
2、初步掌握人外周血淋巴染色体的制备技术。
实验用品1.设备：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（带照相装置）、分水恒温培养箱、干燥箱、卧式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸汽灭菌器、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、，10ml培养瓶（可用环磷酰胺瓶代替）、2ml注射器、吸管、滴管试管架、三角瓶、染色瓶、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷板、铝饭盒、酒精棉球、消毒用碘棉球等。
2、材料：人外周血3.试剂：rpmil 640培养基（含10~20%小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、PHA、青霉素、链霉素、肝素、5%NaHCO 3溶液、1mol/lhcl、三重蒸馏水或二重蒸馏水、0.075mol/lkcl、甲醇、冰醋酸、吉姆萨储备液、pH 6 8磷酸盐缓冲液。
实验原理根据测量，健康成年人的淋巴细胞总数约为500×109，其中约2%在外周血中循环。
外周血淋巴细胞主要为小淋巴细胞（每毫升血液中的淋巴细胞含量可达1~3）×106）。
在正常情况下，它们处于间期的G0或G1期，因此很难看到分裂的淋巴细胞。
然而，Nowell （1960）发现，植物血凝素（PHA），一种从芸豆（菜豆）中提取的能够凝集红细胞的物质，可以刺激淋巴细胞有丝分裂。
在PHA的作用下，G0期淋巴细胞可转化为淋巴细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂。
体外培养约72小时后，大多数淋巴细胞处于第二个增殖周期。
此时，用有丝分裂阻断剂秋水仙碱治疗细胞，可以停止中间阶段的细胞分裂，然后进行低渗固定，其他治疗可以获得更多的中期染色体用于分析。
以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方便，用血量少（0.3～1.0ml即可），培养简单等优点，故该方法在临床上已得到广泛的应用。
内容和方法一、器材的清洗1.清洁培养瓶；将培养瓶在肥皂水中煮沸30分钟，趁热刷洗，然后用自来水冲洗肥皂。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。
说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。
这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。
毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。
乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。
血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。
简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。
你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。
先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。
想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。
咱们要讲到“染色体标本制备”了。
这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。
你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。
所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。
为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。
你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。
在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。
人类外周血染色体标本制备
14、染色（ Giemsa staining） Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15、镜检（microscopic examination）
四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80％
小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)
植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 青霉素终浓度 链霉素终浓度
10、再固定： 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰3），固定 20分钟。
11、再离心
1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。
12、再固定 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰1）打匀，固定 20分钟。
13、制片
固定后， 1000rpm离心10分钟，留下 0.2ml 沉淀物，吸取细胞 悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯 焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（dir drying）。
5、 甲醇 （ methanol ）
6、 冰醋酸 （acetic glacid）
二者以不同比例配合使用
新鲜配制
７、吉姆沙染液（Giemsa）
吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成 先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘油，在研钵 中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸 过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入 磷酸缓冲液即可染染色体标本。
1份Giemsa原液＋ 9份磷酸缓冲液
８、磷酸缓冲液(pH 6.8)
溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。 溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。 100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮 电源指示灯 电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 焦距粗\微调螺旋 集光镜 视度调节圈
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 载物台左右推进螺旋 集光镜 焦距粗\微调螺旋 视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体 图谱，并注明分组编号（A,B和G组） 注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 6学时一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
向标本。
三、仪器设备显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。
四、相关知识点（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。
2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。
2）超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。
为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。
3）洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。
4）火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
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外周血淋巴细胞
PHA 37℃ 68h
G0期或G1期
秋水仙素 至72 h
三、实验用品
• 1.材料：人体外周血 • 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸 管、恒温水浴锅等 • 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μ g∕ml）、植物凝 集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙 酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。
六、实验注意事项
1.接种的血样愈新鲜愈好 。 2.培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效 价外。培养的温度和培养液的酸碱度也十分 重要。 3.培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶 轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温 箱内培养。 4.制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞 膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开,可将 固定时间延长。
每组上交2张未经染色染色体标本。
低渗处理 Giesma染色 R—带
Giesma染色 C—带
Giesma 染色 G—带
Ba(OH)2 处理
荧光染料染色 Q —带
染色体带的制作方法
二、实验原理
外。 当在培养基中加入植物凝集素（PHA）时，小淋 巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始 进行有丝分裂。 经过短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固 定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的 细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察. 这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。
实验方法
2.染色体的制备
（1）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以1500 转/分离心10分钟，弃去上清液，留下沉淀物约0.3ml。 （2）低渗处理：加入预温37℃的低渗液至8ml，用吸管轻吹打 混匀，置于37℃恒温水浴锅中低渗20分钟 。低渗后吹打要 轻,以防细胞破裂. （3）预固定：缓缓加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3: 1），立即用吸管轻吹打混匀。以1500转/分离心10分钟，弃 上清液， 留约0.3ml沉淀物。 （4）固定：加入新鲜固定液至8ml，吸管吹打混匀，室温固定 20分钟， 1500转/分离心10min，去上清液。依上述方法再 重复固定1次。
人类染色体标本的制作
细胞与遗传学教研室
一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征
24hrs 时加 入 BrdU
68 hrs 时加 入秋水仙素
人类外周血
植物血球凝集素 ( PHA） 肝素、培养基、小牛血清
体外培养
72 hrs 后 收集细胞
制作玻片标本
固定
预固定 紫外线照射
实验方法
（5）制备细胞悬液： 预留0.2～0.3ml固定液 ，加2滴新配固定液制成细胞悬 液 （6）滴片： 吸取细胞悬液，滴2～3滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火 焰上过火后，空气干燥。(每组3张，只染1张） （7）染色： Giemsa染液染色10分钟，自来水轻冲洗，晾干，镜检。
五、实验结果
• 在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分 裂相，再转至油镜观察。
四、实验方法
1.外周血细胞培养
（1）采血：无菌，肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素0.2ml,润湿针筒,推出多 余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。） （2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）, 接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀， 37℃培 养箱中培养68小时。 （20滴） • • （3）秋水仙素处理：0.05～0.4μ g∕ml培养基，轻 摇混匀后，继续培养至72小时 。