人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析一、实验目的（1）、熟悉淋巴细胞体外培养原理。
（2）、掌握人体微量血液体外培养技术。
（3）、通过本次实验掌握制备染色体标本的方法。
（4）、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
（5）、培养学生的自主能力，锻炼学生的动手操作能力。
二、实验原理外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G1期（或Go期）一般情况下是不再分裂的在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养秋水仙素的处理低渗和固定就可获得大量的有丝分裂细胞。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮 电源指示灯 电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 焦距粗\微调螺旋 集光镜 视度调节圈
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 载物台左右推进螺旋 集光镜 焦距粗\微调螺旋 视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体 图谱，并注明分组编号（A,B和G组） 注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 6学时一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
向标本。
三、仪器设备显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。
四、相关知识点（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。
2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。
2）超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。
为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。
3）洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。
4）火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
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感谢您的观看
04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
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人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead 等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为
人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：
（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。
实验试剂
RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制
0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):
A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克
KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克
溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中
实验设备
2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
人的外周血淋巴细胞
实验步骤
1．器皿清洗灭菌
清洗：洗衣粉煮、洗液浸泡，流水冲洗，双蒸水冲洗
灭菌：烘箱干热灭菌160℃，30分钟（玻璃器皿）
湿灭15磅，30分钟（药品，KCl，秋水仙素）
2．培养基的制备与分装
成分：PRMI1640 80%（培养液：多种氨基酸，维生素，糖，无机盐）
小牛血清20% (细胞繁殖促进剂，4℃保存，用前50℃灭活，30分钟)
PHA0.04mg/ml
双抗或庆大霉素：100单位/ml
灭菌：RPMI 1640 经抽滤灭菌
分装：5ml/ 瓶，4℃保存
3．接血培养
接血：注射器用肝素湿润后抽静脉血0.3ml/瓶，7号个头15滴。
培养：37℃恒温培养66-72小时，不时摇动。
阻断：收集前2-4小时加秋水仙素，使其终浓度为0.4-0.8μg/ml(7号针头2
滴，6号针头3滴)。
4．细胞悬浮液制备与制片（离心管中操作）
（1）收集细胞：2000rpm 10 分钟，弃上清，用吸管打匀沉淀。
（2）低渗：加入5ml温育的0.075Mol/L Kcl，用滴管轻轻冲打成细胞悬浮液，37℃培养30分钟，使红细胞、血小板破碎，白细胞膨胀。
（3）预固定：加管壁缓缓加入1ml固定液（以免砸碎细胞），静置5分钟。
固定液使红细胞破裂后出来的血红蛋白变性，防止白细胞聚集成团。
（4）收集白细胞：2000rpm，10分钟，弃上清。
（5）再固定：加入5ml固定液，静止30分钟，白色絮状物为白细胞。
2000rpm，10分钟，弃上清。
（6）制片：加入固定液0.4ml，用滴管小心冲打成细胞悬浮液。
距4℃预冷的载玻片半米处滴片，2-3滴/片，吹片。
（7）干燥：37℃干燥。
（8）染色：用Geimsa染色液染色30分钟，然后倒去多余染液，并用蒸馏水轻轻冲洗。
（9）镜检：待稍干后，在显微镜下观察。