人外周血淋巴细胞培养及染色体观察-SJTU
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。
通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。
G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
实验意义—物种的鉴别
物种亲缘关系的确定 ——进化树
蛙(22)
牛( 60, XY)
猪(38, XX)
2N = 38, XX
XX
猫(38, XY)
大猩猩(46,XY)
非洲小人猿(46, XX)
四、实验内容—实验操作流程
抽血
37℃培养3天
对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域 很少着色； • E(16～18)包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对 近端着丝粒染色体； • F(19～20)为两对的中着丝粒； • G(21～22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体，可见随体； • Y常呈现固缩状态着色更深。
实验意义
一部分患者（约1/4）有智力低下，一些患者还有精神异常 及患精神分裂症倾向。
性染色体畸变—
Jacobs综合征
XYY男性的表型正常， 患者身材高大，常超过 180cm。
XYY个体易于兴奋，易 感到欲望不满足，厌学 ，自我克制力差，易产 生攻击性行为。
XYY核型是父亲精子形 成过程中第二次减数分 裂时发生Y染色体不分 离的结果。
加入固定液2ml，细胞立即变黑
立即冲打均匀
室温下固定15min
离心后倒去上清液
离心后管底细胞为白色
白细胞
8、再固定：加入固定液1ml（2只离 心管共需2ml） ，用吸管轻轻打散， 室温下继续固定15min以上（过夜也 可以）。
9、再离心：倒去上清液，留下白细 胞制片。
第二次固定，加入固定液1ml
冲打均匀
室温下固定15min以上
离心后倒去上清
10、制片：滴入固定液0.2ml，用滴管小心冲打 成悬液，从冰箱中取出冰盒将载玻片（每人一 片）平置于冰盒上，自高处（1m以上）滴加 悬液，每片1‾2滴，将滴好的玻片放在玻璃架 上，在酒精灯火焰上烤干。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备的几点体会
表 4 关联系数表
ξ1 (k) 1 013657 014099 017400 013978 013993 013333 017198
ξ2 (k) 1 016674 017472 016985 017439 016446 015066 014891
ξ3 (k) 1 019643 016928 018139 017930 017347 015890 018469
计算关联度 :
γ1 =
1 8
(1 + 013657 + 014099 + 017400 + 013978 + 013993 +
预固定 :加入 1ml 固定液 (甲醇 :冰醋酸为 3 :1) 混匀预固
定 5min 。以 1000r/ min 离心 10min ,弃去上清液 。 固定 :加入固定液 5ml ,立即用吸管吹打细胞团块使之混
匀 ,室温下固定 20min ,离心 ,去上清液 。依上法重复固定 2 ～3 次 。
滴片 :将固定后的沉淀物加新鲜固定液 013～015ml (视 细胞多少而定) ,用吸管吹打混匀 ,制成细胞悬液 。吸取细胞 悬液 2～3 滴 ,以约 20cm 或更高的距离滴于清洁冰湿的载玻 片上 ,并轻轻吹一口气 ,以助细胞 、染色体分散 。室温晾干 。
收获细胞 : 将培养物移至离心管中 ,以 1000r/ min 离心 10min ,弃去上清液 ,沉淀物约留 015～1ml 。
低渗 :加入 6ml 已预温 37 ℃的 01075M KCI 低渗液至离 心管中 ,用吸管轻轻吹打均匀制成细胞悬液 ,置 37 ℃温箱内 , 以使红细胞破坏 ,淋巴细胞膨胀 ,染色体分散 。
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备
乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
•
1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各 试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
•
•
完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体 标本制备,染色体组型分析
实验目的
•
1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与 染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
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实验原理
•
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞 和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情 况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后， 淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行 有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的 处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行 染色体标本制备和核型分析。
•
9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。 从冰箱的冰格中或冰水 中取 出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒 去染液,用蒸馏水轻 轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高 倍油 镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
• •
1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、 载玻片，常规清洗烘干，培 养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理， 天平、离心机、恒温培养 箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品 完全培养基 凝血素(PHA ) 5mg/ml
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性染色体畸变—
Jacobs综合征
XYY男性的表型正常， 患者身材高大，常超过 180cm。
XYY个体易于兴奋，易 感到欲望不满足，厌学 ，自我克制力差，易产 生攻击性行为。
XYY核型是父亲精子形 成过程中第二次减数分 裂时发生Y染色体不分 离的结果。
6、离心：以1000转/min，离心5min，弃去上清 液，收集白细胞。
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮
电源指示灯 电源开关
转速显示 时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，离 心，倒去上清液，留下白细胞。
对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区 很少着色； • E(16～18)包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对 近端着丝粒染色体； • F(19～20)为两对的中着丝粒； • G(21～22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体，可见随体； • Y常呈现固缩状态着色更深。
实验意义
一般来说，X染色体愈多，智力损害和发育 畸形愈严重。
实验意义—物种的鉴别
物种亲缘关系的确定 ——进化树
蛙(22)
牛( 60, XY)
猪(38, XX)
2N = 38, XX
XX
猫(38, XY)
大猩猩(46,XY)
非洲小人猿(46, XX)
四、实验内容—实验操作流程
抽血
37℃培养3天
46,XY
46,XX
人类男性、女性正常的染色体组成
先天愚型Down Syndrome (唐氏综合征)
又称为伸舌样痴呆， 21三体综合征。患者 通常精神发育迟滞或 智力低下（mental retardation, MR）， 智商通常在25‾50之 间。行为、动作倾向 于定型化，抽象思维 能力受损最大。
性染色体畸变—Turner综合征
又称为45，X或 45，XO综合征、 女性先天性性腺 发育不全或先天 性卵巢发育不全 综合征。
患者表型为女 性，身材矮小， 智力一般正常， 但常低于其同胞 。
性染色体畸变—47，XXX综合征
X女性综合征，又称为超雌(superfemale)； 多数具有三条X染色体的女性无论外形、性功能 与生育力都是正常的，只有少数患者有月经减 少、继发闭经或过早绝经等现象。大约有2／3 病人 智力稍低，并有患精神病倾向；
人类染色体畸变的检查 物种的鉴别
染色体畸变
染色体畸变可分为常染色体畸变和性染 色体畸变两种。一般而言，常染色体畸变的 智力缺陷较性染色体畸变严重。染色体畸变 包括数目和结构改变。数目改变如多倍体、 非整倍体。结构改变如染色体断裂、缺失、 重复、倒位和易位，从而影响到染色体上相 应基因遗传信息的传递，引起机体遗传性状 的改变，可产生疾病。
时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋
巴母细胞，随后进入有丝分裂
染色体各部位名称
人染色体
人类正常体细胞有46条 (23对)染色体，其中22对 为常染色体，另外还有1 对性染色体，正常男子 是46，XY；正常女子是
46，XX。
人类染色体分组
• A(1～3)：最大的中部着丝粒的一组染色体； • B(4～5)：两对大的亚中着丝粒染色体，有明显的长臂和短臂； • C(6～12)：中等大小的亚中着丝粒染色体，X大小介于其间； • D(13～15)：中等大小的端着丝粒染色体，具有随体，随体是一
自静脉采血
血液接种
细胞培养瓶
37℃培养
培养68‾72h，加入秋水仙素
5、低渗处理：小心的从水浴箱取出培养瓶，倒 去上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育 的低渗液(0.075mol/L的KCl溶液) 5毫升，用滴 管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中，置 37℃水浴箱内处理20min，使红细胞破碎，白 细胞膨胀。
KCl低渗处理20min 秋水仙素同步化处理2h
离心收集白细胞
固定液处理2次
镜检
染色、制片
实验步骤
1、培养液的准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
Patau综合征
又称13三体综合征
患者通常颅面和手 的畸形 ，智力发育 障碍见于所有的患 者，而且程度严重 ，存活较久的患儿 还有癫痫样发作， 肌张功能低下等。
Edward综合征
18三体综合征
18三体导致严重畸形， 在出生后不久死亡。95％ 的病例有先天性心脏病， 如室间隔缺损、动脉导管 未闭等，这是死亡的重要 原因。肾畸形，肾盂积水 也很常见。患儿智力有明 显缺陷，但因存活时间很 短，多数难以测定。
人外周血淋巴细胞培养 及染色体观察
一、实验目的
掌握人体微量血液体外培养制 备染色体标本的方法
观察人类染色体的形态，并计 数、配对、分类和绘图
二、实验材料与器材
三、实验原理
淋巴细胞
人外周血液中的小淋巴细胞，几乎
都处在G1期（G0期），一般情况下是 不再分裂的
在培养液中加入植物凝血素(PHA)
实验用药品
细菌过滤器
细菌过滤器拆分图
细 菌 过 滤 器 的 使 用
2、采血：
3、培养：将新鲜血液接种于盛有培养基的培养瓶中 ，直立置37ºC±0.5ºC恒温水浴箱内培养，培养 66‾72h。
4、秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度 为40μg/ml的秋水仙素0.05‾0.1ml,最终浓度为 0.4‾0.8μg/ml，置温箱中处理2‾4h。
猫叫综合征
也称5p-综合征。患婴的哭叫声非常似小猫的 咪咪声，故得名。患儿面部表情似乎很机灵 ，但实则智力低下（智商常低于20），发育 迟滞也很明显。患者的死亡率低，许多能活 到成年。
性
染
色
体
畸
变
47,XXY 47,XYY
45,X0 47,XXX
性染色体畸变—Clientele综合征
患者性染色体为XXY，比正常男性多了一条X染色体，因 之亦常称为XXY综合征。患者男性第二性征发育差，有女 性化表现。患者身材高，四肢长。