外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法
107第 30 卷第 1 期2012 年 2 月广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 1Feb. 2012实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养了使学生更好地了解和掌握消毒灭菌知识和技能，学生分析和解决问题能力、培养严密的思维方法和通过在PPT 上讲解后，再由带教老师用实物进行操踏实肯干的工作作风等方面具有不可替代的作用。
作演示。
这个过程加强了学生的无菌操作意识，树要使实验室成为推行素质教育、培养学生创新精神立学生的无菌概念。
和实验能力的主要阵地，必须突破传统的教学观念 1.2 通过实际操作，培养学生动手实践的兴趣，确和教学模式，探讨不同层次、具有特色的、多样化立严格的无菌操作观念的实验教学方法。
《医学遗传学》是高等医学院校在经过适当改装后的实验室里，带教老师向学的一门必修课，外周血淋巴细胞培养和染色体制备生讲解细胞培养基的配制方法及要求后，由学生自是这门课程的重要实验教学项目之一，是综合性实己操作。
配制培养基是实验的重要环节之一，要求验项目。
该实验包括灭菌技术、培养基配制、采血在无菌条件下操作。
以往因为实验室条件所限，必接种、细胞培养、收集细胞制备标本、Ｇ显带处理须用预先在无菌实验室里配制好的培养基给学生做[1-2]和镜下观察分析等内容，实验过程繁琐，耗时实验，如果使用市售的培养基则成本费用高，并且长。
根据目前学生人数多以及本实验的特点，我们学生都没有动手的机会。
由于配制培养基是一项细进行了以下教学方法的探索和改进：微且繁琐的实验过程，一旦失败则后面的实验无法进行，要求带教老师把每一个细小的环节都仔细向1 多种实验手段结合，使繁琐的实验简单化学生交代清楚，包括一些操作的动作要领和容易出现的问题。
有些学生会忘记按无菌操作要求用酒精1.1 运用现代教学手段，了解实验中使用器械、物灯高温消毒试管口和玻璃器皿，或者忘记消毒玻璃品的清洗消毒灭菌程序安培，教师要预先强调并密切观察学生的操作，及由于学生初次接触本实验使用的仪器设备和试时纠正其错误，避免培养基被污染。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
2021人体外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析范文2
2021人体外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析范文 细胞培养论文（专业范文8篇）之第三篇 摘要：对男性、女性的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析发现，在“男1”、“女2”视野中均可找到分散较好、形态较清晰且数量为46条的淋巴母细胞染色体。
介绍了不同秋水仙素终浓度(0. 3μg/ml、0. 6μg/ml)对染色体中期分裂相的影响，认为这两种终浓度的秋水仙素均适合应用到人外周血淋巴细胞染色体的制备过程当中。
找出了分裂相数量较少的原因，如PHA浓度、秋水仙素的细胞毒性、滴片的高度或力度不合适。
要多考虑秋水仙素浓度、秋水仙素处理时间这两个指标，进而找出染色体制备的最优因素水平组合。
关键词：人体外周血淋巴细胞,细胞培养,染色体核型 人体外周血中的淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，本实验对其进行体外培养，用植物血凝素(PHA) 将其转化为可进行有丝分裂的淋巴母细胞，再经72 h恒温培养、秋水仙素处理、低渗、固定、制片等步骤，得到了处于有丝分裂中期的分裂相。
1材料和方法 1.1材料、试剂与仪器 人体外周血淋巴细胞:采集男性、女性静脉外周血样各一份。
试剂:RPMI-1640培养粉等。
仪器:恒温培养箱等。
1.2方法 第一，配制低渗液溶液，进行器皿灭菌等其他准备。
第二，采血，对样本细胞进行收集、培养、染色、镜检。
第三，分析染色体核型。
2结果 2.1男性、女性淋巴母细胞染色体显微拍摄结果 经光镜观察，发现“男1”、“男2”、“女1”、“女2”染色体均呈紫红色，细胞核蛋白与染料结合紧密，染色效果较好。
2.2男性、女性淋巴母细胞染色体核型分析及编号图 因“男1”、“女2”视野中均可找到分散较好、形态较清晰且数量为46条的淋巴母细胞染色体，故选用其进行染色体核型分析。
“男1”、“女2”均共有23对染色体，其中，22对为常染色体，另外1对性染色体男性为XY，女性为XX。
按长度顺序、着丝粒类型等指标，可将其分为A～G七组:A组长度最长，着丝粒在中部或接近中部。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮 电源指示灯 电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 焦距粗\微调螺旋 集光镜 视度调节圈
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 载物台左右推进螺旋 集光镜 焦距粗\微调螺旋 视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体 图谱，并注明分组编号（A,B和G组） 注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。
牙鲆外周血淋巴细胞的培养及染色体制备条件的探讨
Ａ ｓｒｃ ：Ｏｉ ｏ ｎ ｅ Ｐ ｒｌｈｈ ｓｏｖ ｃｕ ）ｗ ｓｕｅ ｘｌｒ ｔｅｃｎ ｉｏ ｆ ｈ ｅｉｈ ｒｌ ｌ ｄｌ — ｂｔａ ｔ ｌ ｅｆ ｕ ｄｒ（ ａａｉ ｔｙ ｌ ａｅｓ ａ ｓｄ ｔ ｅ ｐ ｅ ｈ ｏ ｄｔ ｎ ｏ ｔｅｐ ｒ ｅａ ｂ ｏ ｙ ｖｌ ｃ ｉ ｏ ｏ ｉ ｐ ｏ ｍ
结果表明 ： ．ｍｌ ３５ 培养 基中加入 ０ ２ ｌ ． ｍ 全血 ，１ 下用终浓 度为 ０ １ ｒ ｌ Ｃ ｎ ２℃ ． ｍ／ｍ 的 ｏＡ为刺激 源培养 ４ ｈ 在 结束培养 ８，
前４ ｈ加入终浓度 １５ ／ ｌ ． ｇ ｍ 秋水仙素 ， 渗 ２ ｍｉ 低 ５ ｎ可获得较好 的染色体分 裂相 。 关键词 ： 牙鲆 ；外周血淋 巴细胞 ； 染色体 制片
Ｍ Ｉ ４ ｏ ｅ ｃ ｌｕ ｅ ｍ ｅ ｕ ． Ｔｈ ｏ ｉｉｎ ｆｔ ｅ ｐ ｒｐ ｅ ａ ｌ ｏ ｙ ｐ ｏ ｙ ｉ ｅｌｃ ｌｉａ ｉｎ ａ ｄ ｃ ｒ ｍｏ ｏ ｅ ｌ ０ ｗｈ ｌ ｕ ｔ ｒ ｄｉｍ ６ ｅ ｃ ｎｄ ｔ ｓｏ ｈ ｅ ｉｈ ｒ ｌｂ ｏ ｄ ｌｍ ｈ ｃ ｔ ｃ ｌ ｕ ｔ ｔ ｎ ｈ ｏ ｓ ｍ ｏ ｃ ｖ ｏ
摘要 ：以牙鲆为试验 材料研究探讨 其外周血淋 巴细胞培养及染色体制备 的条件方法 。用 Ｒ ＭＩ ６ ０全血培养基进 Ｐ ４ １
行培养 ， 从培养温度 、 培养时间、 刺激源 Ｐ Ａ和 Ｃ ｎ 秋水仙素 处理时刻 及处理浓度 、 Ｈ ｏ Ａ、 低渗处理 时间等方 面对 外周 血淋 巴细胞 的培养及 其染色体制备条件进行探讨 ， 建立 较成 熟的牙 鲆外周 血淋 巴细胞 培养 及染色体 制备 的方法。
中图 分 类 号 ： ３ ３ Ｑ ４ 文献标识码 ： Ａ
Ｓ ａ ｃ ｏ ｒｐｈｅ ａ ｏ ｄ Ｌｙ ｐ ｃ ｔｃ ＣｅｌＣｕｌｉａ ｉｎ ｎ ｅ ｒ ｈ ｆ ｒ Ｐｅ ｉ ｒ ｌＢｌ ｏ ｍ ｈｏ ｙ ｉ ｌ ｔｖ ｔｏ ａ ｄ
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备
乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
•
1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各 试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
•
•
完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体 标本制备,染色体组型分析
实验目的
•
1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与 染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
•
实验原理
•
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞 和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情 况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后， 淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行 有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的 处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行 染色体标本制备和核型分析。
•
9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。 从冰箱的冰格中或冰水 中取 出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒 去染液,用蒸馏水轻 轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高 倍油 镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
• •
1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、 载玻片，常规清洗烘干，培 养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理， 天平、离心机、恒温培养 箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品 完全培养基 凝血素(PHA ) 5mg/ml
人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究
人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究近年来，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术受到了研究者们的极大关注，为研究人类基因组的结构、组成、表达、功能以及毒性性质等提供了重要的理论支持。
一、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术1、技术基础：染色体制备技术基于染色体延伸链分析技术，可以在特定细胞类型中获得更多有关人外周血淋巴细胞的信息。
2、实验方法：首先，经过放免定向损伤，用VP-16/Adr真核表达载体PCR形成染色体重组，生成环状染色体；然后，用PCR用LUC7+2分离染色体，形成环染色体；最后，用IMD技术将染色体细化为单个的LUC7+2染色单体，并用Cross-Linking（CL）技术衍生细胞凋亡程序，即可获得高分辨率的染色体。
二、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术的应用1、研究基因表达和表达调节：通过对人外周血淋巴细胞的染色体制备，可以研究基因表达和表达调节机制、调控水平及其功能，有助于研究人体健康和病理状态的机制。
2、研究药物作用：人外周血淋巴细胞的染色体制备技术可以很好的帮助研究中药的作用机制及其药效，为临床治疗使用提供理论依据。
三、未来发展1、对不同类型细胞的染色体制备技术的研究：进一步研究不同细胞的染色体制备技术，提供更多的信息，以更好地研究基因结构和功能。
2、研究不同材料的染色体制备技术：进一步完善不同类型材料染色体（如核酸、细胞类型或体液类型）染色体制备技术，为研究更多的生物信息提供参考。
综上所述，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术日益受到研究者们的重视，他们可以利用这项技术研究人体健康状态及病理状态机制、研究药物作用机制和提供理论依据来指导临床治疗，为健康科学发展提供重要理论支撑。
未来，研究将持续着眼不同类型细胞和不同材料染色体制备技术，更加完善技术，帮助研究者更好地了解人体基因组结构、表达、功能和毒性性质的信息。
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RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。
红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。
笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。
M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。
参考文献[1]丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9.(收稿日期:2010-12-16)v通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin 。
#经验交流#外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元v(川北医学院附属医院检验科,四川南充637000)摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。
方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。
结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。
结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。
关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。
然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。
为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。
笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。
1 淋巴细胞培养1.1 外周血采集 一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。
然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。
为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。
在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。
1.2 接种 培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。
本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。
接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。
经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。
1.3 细胞培养 细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。
1.3.1 培养时间 经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。
因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于分析。
1.3.2 培养温度与气体 淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。
如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。
气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。
CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。
大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。
偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。
培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。
2 细胞收获2.1 秋水仙素与作用时间 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。
加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。
加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。
只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。
本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。
2.2 离心力 将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。
整个过程中,离心力的大小很关键。
离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。
这一步本室选择1900r /min 离心10min 。
而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。
为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。
此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。
2.3 低渗 低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。
低渗液渗透压过低、低渗时间过长会使核膜破裂,染色体提前释放,这不仅会使分裂中期细胞减少,散在的染色体也会在滴片过程中随机分布在载玻片上,影响其他细胞的染色体计数,降低制片质量;低渗时间过短,一部分细胞的细胞膜未破裂,导致染色体释放障碍,同样不利于核型分析。
本室采用常规的0.075mo l/L K Cl溶液8mL,低渗(30?5)min,可获得足够数量的分裂中期细胞。
3固定收集细胞过程中加入固定剂的目的是维持染色体的形态。
一般实验室使用的都是按甲醇B冰乙酸=3B1比例配制的混合液。
一方面,固定剂可以使细胞脱水、蛋白质变性而使染色体变得粗大并适中;另一方面,有机溶液可以让红细胞破裂,通过离心可以获得比较纯净的淋巴细胞。
固定液需新鲜配制,主要是由于固定液所含的水分和固定效果有关。
另外,可以适当增加冰乙酸的比例来达到良好的效果[4]。
4制片与烤片4.1细胞悬液配制经过低渗、预固定、固定,即获得淋巴细胞。
此时的细胞非常脆弱,在配制细胞悬液时要轻轻地吹打混匀,吹打方式或者力量不当,都会使核膜破裂,造成染色体释放。
此外,细胞悬液的浊度也要适中,悬液浊度太小,制片后载玻片上细胞数量少;浊度太大也不利于染色体分散,染色体交叉,均不利于分析。
4.2滴片滴片质量的好坏也是染色体制作的关键步骤之一。
在制片时,载玻片的清洁度将直接影响细胞的贴附能力。
因此,在制片前,载玻片要经泡酸处理,以清除载玻片上的阴阳离子与杂质。
适当的滴片高度也是获得高质量染色体的必然要求。
高度过高,染色体分散范围过大,甚至造成染色体丢失;高度过低,则染色体分散不良。
经过探索,本室滴片的高度保持在8~15cm,能获得比较好的分裂象。
4.3烤片烤片温度的高低和时间的长短会影响显带标本的质量,掌握好适宜的烤片温度和时间,才能制备高质量的显带标本[5]。
烤片温度过高、时间过长,胰酶对标本的消化时间也随之增加,这既影响工作效率,也影响标本的显带质量,使显带达不到最佳效果。
烤片温度过低、时间过短,标本的老化程度不够,不能很好地把握胰酶消化的时间,导致消化不足或过度。
所以,适当的烤片时间和温度也是获得高质量染色体的必然要求。
本室采用72e烤片1.5~2h,可获得质量优良的标本。
5消化与染色5.1消化G显带标本是临床上运用最多的显带技术。
无论细胞培养、制片、烤片过程做得多么完美,如果没有很好地把握消化与染色过程,也不能获得显带清晰的染色体。
消化过程是去除染色体上的蛋白质(包括组蛋白和非组蛋白)而获得良好的显带标本,通常用的消化酶为0.025%的胰蛋白酶。
然而,消化时间根据胰酶的浓度、质量不同而定,不同的实验室消化时间不一,即使同一实验室不同时间消化所需的时间也不同。
这就要求实验人员在每次批量消化之前都要进行条件摸索,以获得最佳的实验条件。
5.2染色G显带用的染液为姬母萨染液,既可以自己配制,也可以购买商品化的试剂。
染色体制作本身是一个受多因素的影响过程,染液的质量也会影响染色体的着色。
本室购买的湖南湘雅基因技术有限公司的商品化的姬姆萨染液,具有方便、质量稳定的优点。
由于放置过久的姬姆萨染液有效成分会下沉,用之前需摇匀,才能获得质量良好的制片。
另外,姬姆萨染液对稀释液的pH值也有一定的要求,本室采用pH7.4的PBS作为稀释液,即可获得清晰的染色体图像。
目前,染色体制作过程没有统一的质量控制,试剂生产厂家多,且质量也参差不齐,各实验室制作的染色体质量与实验环境、试剂质量、人员素质均有很大的关系。
为了尽可能的获得稳定的染色体标本,各实验室应该参考其他实验室的成功经验,根据自己实验室条件进行摸索,以获得质量尽可能高的染色体标本。
参考文献[1]朱丽萍,施东华.出生缺陷与产前诊断[J].中国优生与遗传杂志,2002,10(1):12-15.[2]曹海涛.染色体外周血淋巴细胞培养中的几点体会[J].现代中西医结合杂志,2007,16(30):4485.[3]董烁,谢振兴.浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备[J].食品工程,2008(2):25-27.[4]慕明涛,霍满鹏,蒲力群,等.人外周血染色体标本制备失败的影响因素分析[J].延安大学学报:医学科学版,2007,5(4):3-4. [5]赵小平,余红,黄燕,等.烤片对染色体G显带标本质量的影响分析[J].现代医药卫生,2009,25(3):393.(收稿日期:2011-01-27)#经验交流#白细胞计数正常的脑脊液中检出肿瘤细胞病例回顾性分析万均成,文芳,肖玲(武汉大学人民医院神经精神病研究所430060)摘要:目的回顾并探讨白细胞计数正常的脑脊液(CSF)在分类计数中检出肿瘤细胞及其对脑膜癌的诊断价值。
方法用血球计数板计数CSF中的白细胞数,再用玻片离心法收集细胞,瑞-姬染色,镜检。
结果9例患者CSF白细胞计数均小于10个/微升。