人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备
人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 6学时一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液(一般是0.075mol/L的KCl)处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA(植物血球凝集素)或ConA 等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
向标本。
三、仪器设备显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。
四、相关知识点(一)细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。
2、无菌操作的要领和要求1)培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。
2)超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。
为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。
3)洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。
4)火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮 电源指示灯 电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 焦距粗\微调螺旋 集光镜 视度调节圈
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 载物台左右推进螺旋 集光镜 焦距粗\微调螺旋 视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体 图谱，并注明分组编号（A,B和G组） 注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。
外周血染色体标本制作
细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量 的两个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内 结构膨胀或破坏的决定性因索，为此选用等渗液作 为固定剂，其实这种看法是不正确的。事实证明， 稀释的醋酸具有20个大气压，照常可使细胞和组织 膨胀，而只有2.5个大气压的苦味酸却可使组织大大 地收缩。这提示一种固定剂的效果如何与渗透压的 关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀的作用 很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀 这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。 因此，在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡 以上这些因素。
• 用作固定剂的化学物有非金属和金属两类。前者 如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯 仿等。后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝 酸铀等。其中有几种化学物还可作为蒸气固定剂， 也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转 变为不溶性物质，这样就可在原位制作标本。 • 在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂(除甲醛 外)比之于金属固定剂有一优点是，在固定之后无 需在水中冲洗标本。
• 最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色 效果，即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具 有优良固定剂的其它所有特性，但却会降低染色体 的嗜碱性，所以不能单独用作染色体的固定剂。 • 显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些 条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来， 使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如 此，那怕是最佳固定剂仍难免有不足之处。首先， 细胞被杀死后发生的基本变化很难予以避免；其次， 可能会抽提出一些弥散成分；最后即使操作十分谨 慎，仍难以保持酶活性不变；此外，某些化学物还 会导致细胞的皱缩。
• 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优 点是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热 带地区的夏季，那怕气温高达43.3℃，对秋水仙素 的活性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存 在8-9℃的组织中，发现中期细胞的数目比保存在 室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而且染色 体的结构也很清楚。 • 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生 物。它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作 用只有秋水仙素的1/30一1/40。4-6×10-6的浓度即 可得到所希望的效应。 • 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤 体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长 春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。
实验五 人类染色体标本制备
实验五人类染色体标本制备【目的要求】1．熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。
2．初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。
3．了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。
在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。
人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分裂能力。
培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素(PHA)可使处于G0期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/L KCl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。
制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。
【实验用品】(一) 材料：人外周静脉血。
(二) 器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。
(三)试剂1. RPMI1640培养液(1) RPMI1640：RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。
(2) RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血清20 ml、PHA 50 mg、青霉素(终浓度100 U/ml)、链霉素10000 μg (终浓度100 μg /ml)，15磅、20min高压灭菌的NaHCO3调pH至7.2～7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。
(3) 配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2 d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
实验1人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。
(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。
【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。
在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。
但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。
因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。
【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。
2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。
【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。
2、培养至68 -70h。
然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。
3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。
(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。
中途混匀一次。
(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。
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实验原理
人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为
人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：
（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂
RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制
0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):
A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克
KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克
溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中
实验设备
2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
实验材料
人的外周血淋巴细胞
实验步骤
1．器皿清洗灭菌
清洗：洗衣粉煮、洗液浸泡，流水冲洗，双蒸水冲洗
灭菌：烘箱干热灭菌160℃，30分钟（玻璃器皿）
湿灭15磅，30分钟（药品，KCl，秋水仙素）
2．培养基的制备与分装
成分：PRMI1640 80%（培养液：多种氨基酸，维生素，糖，无机盐）
小牛血清20% (细胞繁殖促进剂，4℃保存，用前50℃灭活，30分钟)
PHA0.04mg/ml
双抗或庆大霉素：100单位/ml
灭菌：RPMI 1640 经抽滤灭菌
分装：5ml/ 瓶，4℃保存
3．接血培养
接血：注射器用肝素湿润后抽静脉血0.3ml/瓶，7号个头15滴。
培养：37℃恒温培养66-72小时，不时摇动。
阻断：收集前2-4小时加秋水仙素，使其终浓度为0.4-0.8μg/ml(7号针头2
滴，6号针头3滴)。
4．细胞悬浮液制备与制片（离心管中操作）
（1）收集细胞：2000rpm 10 分钟，弃上清，用吸管打匀沉淀。
（2）低渗：加入5ml温育的0.075Mol/L Kcl，用滴管轻轻冲打成细胞悬浮液，37℃培养30分钟，使红细胞、血小板破碎，白细胞膨胀。
（3）预固定：加管壁缓缓加入1ml固定液（以免砸碎细胞），静置5分钟。
固定液使红细胞破裂后出来的血红蛋白变性，防止白细胞聚集成团。
（4）收集白细胞：2000rpm，10分钟，弃上清。
（5）再固定：加入5ml固定液，静止30分钟，白色絮状物为白细胞。
2000rpm，10分钟，弃上清。
（6）制片：加入固定液0.4ml，用滴管小心冲打成细胞悬浮液。
距4℃预冷的载玻片半米处滴片，2-3滴/片，吹片。
（7）干燥：37℃干燥。
（8）染色：用Geimsa染色液染色30分钟，然后倒去多余染液，并用蒸馏水轻轻冲洗。
（9）镜检：待稍干后，在显微镜下观察。
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