实验二淋巴细胞分离实验
淋巴细胞分离过程中去除红细胞和血小板的方法
为获得高纯度淋巴细胞，必须进一步清除PBMC悬液中其他血细胞。
（一）去除红细胞：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。
低渗裂解法是加1ml蒸馏水于沉淀的PBMC中，不超过1min，红细胞即快速裂解，立即加入等量的 1.8%氯化钠溶液恢复为等渗状态，经洗涤即可去除红细胞。
氯化铵处理法是在沉淀的PBMC中加入1ml 0.83%氯化铵溶液，轻轻振摇2min，即可裂解红细胞，经洗涤即可去除红细胞。
红细胞裂解液的制备：碳酸氢钾（KHCO3）1.0g；氯化氨（NH4Cl）8.3g；EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至1000ml，即工作液。
（二）去除血小板：通过离心洗涤，即可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。
若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清（FCS）梯度离心法去除PBMC 中混杂的血小板。
[将PBMC悬液洗涤2~3次后，常可去除绝大部分混杂的血小板。
某些疾病状态下，外周血中血小板数量增多，常需通过胎牛血清（FCS）梯度离心才能去除过多的血小板，因FCS可让单个核细胞通过而阻止血小板通过。
] Place 3 ml FCS in a 15-ml centrifuge tube and carefully overlay with PBMC. Centrifuge 15 min in a GH-3.7 rotor at 800 rpm (200 g), 18℃to 20℃. Discard supernatant, which contains platelets. Resuspend pellet in HBSS/FCS at 2-5×107 cells per 1 to 2 ml. [Fetal calf serum (FCS; heat-inactivated 1 hr, 56℃)]（三）去除单核细胞和粒细胞：单核细胞的去除：①粘附去除法：单核细胞能粘附在塑料或玻璃的表面，而淋巴细胞则不能，由此可将单核细胞从PBMC悬液中分离出来。
兽医免疫学实验教学大纲
兽医免疫学实验教学大纲兽医免疫学实验教学大纲兽医免疫学是兽医学专业中的一门重要课程，它研究动物身体对病原微生物的免疫应答和免疫调节机制。
免疫学实验教学是培养学生免疫学实践能力的重要环节，通过实验教学，学生能够更好地理解和掌握免疫学的理论知识，并培养其实验操作技能。
实验一：抗原与抗体的相互作用在这个实验中，学生将学习抗原与抗体的相互作用原理。
首先，学生将收集不同种类的抗原，如细菌、病毒等，并制备相应的抗体。
然后，学生将进行免疫沉淀实验，通过观察抗原与抗体的反应，来判断抗体的特异性和亲和力。
实验二：淋巴细胞的分离与培养淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞类型，它们在免疫应答中起着关键作用。
在这个实验中，学生将学习淋巴细胞的分离与培养技术。
首先，学生将从小鼠或大鼠的淋巴组织中分离出淋巴细胞。
然后，学生将对淋巴细胞进行培养，并观察其生长和增殖情况。
实验三：细胞毒性试验细胞毒性试验是评价细胞免疫功能的重要方法之一。
在这个实验中，学生将学习细胞毒性试验的原理和操作技巧。
首先，学生将从小鼠或大鼠中分离出淋巴细胞，并与靶细胞进行共培养。
然后，学生将通过测定靶细胞的存活率来评估淋巴细胞的细胞毒性能力。
实验四：酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
在这个实验中，学生将学习ELISA的原理和操作方法。
首先，学生将制备ELISA板，并将抗原或抗体固定在板上。
然后，学生将加入特异性的抗体或抗原标记物，并通过酶的反应来检测目标物质的存在和浓度。
实验五：免疫组化染色免疫组化染色是一种常用的免疫学实验技术，用于检测组织中特定抗原的分布和表达情况。
在这个实验中，学生将学习免疫组化染色的原理和操作方法。
首先，学生将制备组织切片，并进行抗原的抗体染色。
然后，学生将观察组织切片中抗原的分布和表达情况。
通过以上实验，学生将能够全面了解免疫学的基本原理和实验技术，并培养其实验操作技能和科学研究能力。
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
淋巴细胞培养方法
淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，对于研究免疫学以及治疗免疫相关疾病具有重要意义。
淋巴细胞的培养是研究淋巴细胞功能和特性的关键步骤。
本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，以帮助读者了解淋巴细胞培养的基本原理和操作步骤。
一、材料准备1. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。
2. 补充物：培养基中常需添加胎牛血清(FBS)、人血清(HS)等，以提供细胞所需的营养和生长因子。
3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，以防止细菌污染。
4. 受试者淋巴细胞：可以通过外周血或淋巴组织等方式获取。
二、淋巴细胞的分离1. 密度梯度离心法：将受试者淋巴细胞与离心管中的淋巴细胞分离液缓慢加入离心管中，离心分离液的密度逐渐由低到高，使淋巴细胞在不同密度的离心分离液之间分层离心。
离心后，淋巴细胞会沉积在特定密度的离心分离液上，可将淋巴细胞分离出来。
2. 磁珠分离法：利用表面标记有特定抗体的磁珠与淋巴细胞表面的特异抗原结合，通过磁场将目标淋巴细胞与其他细胞分离。
三、淋巴细胞的培养1. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪准确计算淋巴细胞的数量。
2. 细胞密度调整：根据实验需求，将细胞悬浮液中的淋巴细胞浓度调整至适当的浓度，通常为1-2 × 10^6个细胞/mL。
3. 培养基配制：根据实验需要，将培养基加热至37℃后，加入适量的补充物和抗生素，混匀均衡。
4. 细胞培养：将细胞悬浮液与预先配制好的培养基按照适当的比例混合，转移到细胞培养瓶或培养皿中。
5. 培养条件：将细胞培养瓶或培养皿置于37℃恒温培养箱中，设置适当的CO2浓度和湿度，通常为5% CO2和95%湿度。
定期观察细胞形态和生长情况。
6. 培养周期：根据实验需求，定期更换新鲜的培养基，一般为2-3天一次，以保证细胞的正常生长和代谢。
四、细胞活性检测1. 活细胞计数：使用染色剂如Trypan blue染色，观察染色细胞和未染色细胞的比例，以评估细胞的存活率。
小鼠淋巴细胞提取
小鼠淋巴细胞提取一、实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二、实验对象：小鼠三、实验器材：1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台四实验步骤：1、颈椎脱臼处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡2-3分钟，减少毛发造成污染。
2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。
用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。
用镊子捏住切口两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁，用乙醇消毒。
切开腹腔壁膜，用镊子夹住脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织。
3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。
用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。
（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。
离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示。
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。
倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
五、注意事项：①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。
覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告一、实验目的1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础二、实验材料1.淋巴细胞分离液2.EDTA抗凝剂常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固3.PBS缓冲液PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用4.戊巴比妥钠溶液作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。
用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。
5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml）三、实验原理外周血中各种细胞的密度不同。
密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。
第一层为血浆层。
第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层图1 小鼠外周血离心前后示意图四、实验步骤1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1)4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min7.弃上清液，加入4mlPBS待用图2 第一次离心后图片五、注意事项1.EDTA和淋巴细胞分离液使用前应预温至22℃2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在22~25℃，过低或过高应延长或缩短离心时间六、实验思考第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞，应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗凝补充分的缘故。
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
淋巴细胞分离液
二、巨噬细胞吞噬功能测定
实验目的
熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。 了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。
试剂:
1．淋巴细胞分离液（比重1.0770.001）。 2．肝素溶液 用生理盐水配制成500U/ml。 3．Hanks液。 4．2g/L台盼蓝染液。 5．标本 肝素抗凝的人外周静脉血。 6. 白细胞稀释液。
实验方法
1．室温下，将2ml抗凝血与2ml Hanks液混合
抗凝全血 缓冲液
实验方法
2．取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细 吸管将稀释血液4ml沿管壁加入离心管，使 稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液 与稀释血液体积比例为1：2）。
定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培 养板置4C保存。测定前取出，室温静置10min 后再加盐酸异丙醇。
实验讨论
1. 试讨论MTT比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取
哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
福建医科大学 陈敏
实验三 细胞吞噬率与 吞噬指数测定
实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和 核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液。 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌3% NaHCO3调pH至7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。
吸取白细胞层涂片 染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml ) 0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、 5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一 次。
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注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
释不当，需重新制备细胞悬液、计数
试验报告要求
原理, 步骤, 结果, 讨论。
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
ห้องสมุดไป่ตู้
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤 注意事项
实验步骤
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀
释
外
周
血
1500rpm,
20℃ , 30min
Ficoll
Ficoll
稀释的血浆、 血小板 PBMC
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性）
2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取， 沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层 液上方（Ficoll：血细胞=1：1）
实验步骤
3.2000r/min，离心15min
4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移 入另一试管中
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104