B淋巴细胞分离技术
2--淋巴细胞分离技术及玫瑰花环试验
二、实验目的
了解血液中的各种细胞成分及特性。
掌握实验动物外周血中淋巴细胞的分离方法 掌握T、B淋巴细胞的区分方法及T淋巴细胞的计 数方法。
三、实验材料
1. 兔淋巴细胞分离液、 1%绵羊红细胞、 生理盐水、 pH6.4的PBS液、 Hank,s液、瑞氏染色液（I 液）、吉姆萨染色液（II液）、香柏油、二甲苯、 甲醇、 碘酊棉球、75%酒精棉球。 2. 50mL注射器，10ml玻璃离心管、50ml离心管、擦镜纸、 移液枪（枪头）、载玻片、巴氏吸管、镊子等。 3. 显微镜、离心机、
实验五
（一）淋巴细胞分离技术 （二）E玫瑰花环试验
一、实验原理
(一）淋巴细胞的分离：
兔淋巴细胞的方便来源是外周血，此次实验 采用的就是聚蔗糖溶液的密度梯度离心法。外周 血中各种细胞的密度不同，红细胞和多核白细胞 的比重密度较大，1.090左右，淋巴细胞和单核 细胞的密度为1.075～1.090。密度梯度离心法的 原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重 介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心， 使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不 同的独立带，从而达到分离的目的。
SRBC受体(Sheep red blood cell)
T细胞
SRBC
Erythocyte rosette test
红细胞玫瑰花环形成试验
T
B
T
erythrocyte antibody rosette formation test 红细胞抗体玫瑰花 环形成试验
erythrocyte antibody complement rosette formation test 红细胞抗体补体玫 瑰花环形成试验
四、实验步骤
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
详细的淋巴细胞的分离、计数图文教程
<交界液面：一定不要打乱 >
离心 〔200lt;1000rpm,5min> 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与 单核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
细胞计数
本实验：淋巴细胞
实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
数上不数下,数左不数右.
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度〔细胞数/ml>
= 2个大方格内细胞总数
×104×10 <稀释倍数
2
细胞活力检测：〔死细胞被染成蓝色,活细胞不着色
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
稀释的肝素抗凝血,沿管壁轻轻叠加于分离液上, 使两者形成一个清晰地界面.
细胞经离心分层后,缓慢小心吸取,切勿打破形成 的细胞层.
细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系统
自动细胞计数仪
知识回顾 Knowledge Review
T淋巴细胞的分离、计数
XX医学院免疫学教研室
淋巴细胞的分离技术
淋巴细胞的分离技术（一）材料与试剂1．淋巴细胞分层液有两种：（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。
应用时，用蒸馏水配制9％溶液。
泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。
含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。
应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液 24份33.9％泛影葡胺液 10份混合即可。
必要时，可测比重。
需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。
一般可保存3个月。
如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：式中dm为分层液的比重，d1和d2分别为9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分别为它们的体积。
如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液，则9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液 10份60％右旋糖酐液 12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。
分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
2． 3％的明胶液称取明胶3g，溶于0.9％的灭菌生理盐水，终体积100ml，114.3℃高压灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存，临用时37℃预热10min。
3．Hank’s液。
（二）操作方法1．取抗凝血，自然沉降，如是马属动物的血液，可直接直立试管架上，让其自然沉降1h，取上层血浆。
如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明胶液，混匀后让其自然沉降，1h后取上层血浆。
2．2 000r/min离心10min，弃上清。
淋巴细胞分离方法
淋巴细胞分离方法
淋巴细胞是咱们身体免疫系统里超级重要的小战士呢。
那怎么把它们从其他细胞里分离出来呢？这可有不少有趣的办法哦。
有一种方法叫密度梯度离心法。
想象一下，就像把不同重量的东西放在一个超级特别的旋转机器里。
咱们把血液或者含有淋巴细胞的组织液放在一种有特殊密度的溶液里，然后让这个混合液高速旋转起来。
淋巴细胞就像是一群小机灵鬼，它们会根据自己的密度，跑到溶液里特定的位置。
其他细胞呢，就被分离开啦。
就好像是在一场超级有趣的细胞大派对里，淋巴细胞们被安排到了专属的小角落。
还有一种叫免疫磁珠分离法。
这个方法可酷啦。
咱们给淋巴细胞贴上一种特殊的小标签，这个小标签就像是一个小磁铁。
然后把这个带有标签的细胞混合液放在一个有磁场的地方。
那些贴了标签的淋巴细胞就会被磁场吸引住，就像小铁屑被磁铁吸住一样。
这样就能轻松地把淋巴细胞和其他细胞分开啦。
这就像是给淋巴细胞们发了个特别的通行证，只有它们能被磁场这个小保安给挑出来。
另外，贴壁黏附法也很有意思哦。
淋巴细胞不太喜欢黏附在容器壁上，但是有些细胞就特别爱黏附。
咱们把细胞混合液放在一个容器里，过一会儿，那些爱黏附的细胞就像小懒虫一样趴在容器壁上了，而淋巴细胞还在溶液里自由自在地游着。
这时候把溶液取出来，就得到比较纯的淋巴细胞啦。
就好像是在一个细胞宿舍里，那些黏附细胞是赖床的，淋巴细胞是早起活动的，咱们把早起活动的给挑出来就好啦。
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
FluoroBeadsR分离T淋巴细胞和B淋巴细胞
FluoroBeadsR分离T淋巴细胞和B淋巴细胞发布: 2010-02-23来自: 易生物实验阅读数：7899次【原理】免疫磁性微珠表面联结着单克隆抗体的超顺磁性微珠。
这些微珠在磁场中能够聚集在一起。
当移去磁场时，这些磁珠不残留任何磁性。
它们能再被磁化和分散。
连接的单克隆抗体的特异性决定着结合细胞的类型。
分离T细胞【原理】T 荧光微珠提供了一个利用荧光染色进行Ⅰ型HLA 分型试验中分离T 淋巴细胞的简单的步骤。
T 荧光微珠是直径小于1 微米的免疫磁珠。
抗CD2 单克隆抗体包被在微珠表面。
CD2 抗体特异性吸附T 淋巴细胞上的E 花结受体。
通过磁力架从血液中分离T 淋巴细胞／T 荧光微珠复合体。
T 荧光磁珠方法不需要低温孵育、离心分离等步骤。
【注意】人血液的使用必须严格按照操作步骤和实验室操作规范进行。
用手接触标本可能会传染疾病。
【储存条件】T 荧光微珠和T 荧光微珠显色剂要在2－5℃储存并在有效期前使用。
不能冷冻。
T 荧光微珠显色剂需避光保存。
【需要的材料和设备】1.T 荧光微珠（FB1-25；FB1-40；FB1-100）2.T 荧光微珠显色剂（FB1-DEV）（10×储存液）。
工作液（1X），1 份储存液和9 份PBS 混合。
3.Ⅰ型组织分型板4.FQAE（丫啶黄／溴化乙啶）5.磁力架6.1μL 与5μL 加样器7.5mL 试管0.磷酸盐缓冲液（PBS），无Ca++和Mg++盐类0.吸管与吸头【操作步骤】（A）样品采集约需要2ml 的全血。
抗凝剂首选ACD 或CPDA，也可以用肝素钠。
不要使用肝素锂！T 细胞的分离要在24 小时内完成分离以得到最高产量，血液保存3 天内使用，血标本要水平放置在20－25℃储存。
（B）Ｔ淋巴细胞提取方法一：从全血中分离1、在5ml 的试管中放入2ml 血。
2、T 荧光微珠使用前彻底混悬，旋转约10 秒钟。
3、在待测样品中加入150μl 的T 荧光微珠。
淋巴细胞的分离方法[整理]
![淋巴细胞的分离方法[整理]](https://img.taocdn.com/s3/m/c6b23f1f773231126edb6f1aff00bed5b9f373c2.png)
1、淋巴细胞的来源：人淋巴细胞的方便来源是外周血分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。
根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
2、密度梯度离心法：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
3、实验方法：1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）3、20℃，1500r/min，离心30min从上一次至下稀释的血浆、血小板PBMCFicoll红细胞、粒细胞4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。
6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。
7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95%淋巴细胞约占90%～95%4、淋巴细胞高纯度化(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。
(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。
在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。
（三）单核细胞和粒细胞的去除1．粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。
采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。
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B淋巴细胞分离技术
一、实验原理
膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。
由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。
B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。
而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。
现将荧光标记SPA法介绍如下：
二、实验材料
1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。
2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。
3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±0002
4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片
三、实验步骤
1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。
2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。
用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。
3、再用经37℃预热的Hanks液(含5%小牛血清)洗涤离心
4、取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，在荧光显微镜下观察。
四、结果观察
凡淋巴细胞表面粘附5个以上菌体细胞为SmIg阳性。
一般先用暗视野计算荧光阳性细胞数，继用明视野计算同一视野中淋巴细胞总数。
每份标本至少计算200个淋巴细胞，并求出荧光阳性细胞百分率，同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的绝对值。
同时，每个B淋巴细胞表面可带有不同类别的Ig，即IgM、IgG、IgA等，如果分别用单价荧光抗Ig血清染色，则可鉴定不同Ig的B淋巴细胞。
但淋巴细胞数量的多少会影响检出率。
过多或过少时，除难以计数外，染色背景明暗不匀，着色与不着色的细胞难以区别，一般以2～25×106/ml细胞浓度为宜，活细胞数应不少于95%。
五、实验分析
此法特异性强，荧光亮度好，操作迅速简便。
加上试剂有商品供应，可以使本法标准化。
一般SmIg阳性的B淋巴细胞表面或周围均可布满许多黄绿色荧光菌体，很少见到表面只粘附2～3个菌体细胞同时，每个B淋巴细胞表面可带有不同类别的Ig，即IgM、IgG、IgA 等，如果分别用单价荧光抗Ig血清染色，则可鉴定不同Ig的B淋巴细胞。
淋巴细胞数量的多少会影响检出率。
过多或过少时，除难以计数外，染色背景明暗不匀，着色与不着色的细胞难以区别，一般以2～25×106/ml细胞浓度为宜，活细胞数应不少于95%。
实验注意事项
当SmIg抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg出现交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状，时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此染色后，观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。
在滴片前要彻底去除游离的抗体，以避免假阳性结果
备注
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
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本套实验视频制作耗资上百万，由专业的影视和后期制作团队拍摄+生物、医学领域的教授专家指导+Thermo、Roche等著名企业参与共同制作完成。
分子生物学实验技术共6个视频，包括:DNA甲基化检测、分子克隆技术、高分辨溶解曲线分析技术（HRM）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光定量PCR（real time QPCR）、原位杂交（ISH）。
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每个实验视频内容包括详细的实验操作流程，原理讲解，结果分析及疑难解答，并配有相应的详实的文字文档和参考文献！。