淋巴细胞的分离及鉴定
2--淋巴细胞分离技术及玫瑰花环试验
二、实验目的
了解血液中的各种细胞成分及特性。
掌握实验动物外周血中淋巴细胞的分离方法 掌握T、B淋巴细胞的区分方法及T淋巴细胞的计 数方法。
三、实验材料
1. 兔淋巴细胞分离液、 1%绵羊红细胞、 生理盐水、 pH6.4的PBS液、 Hank,s液、瑞氏染色液（I 液）、吉姆萨染色液（II液）、香柏油、二甲苯、 甲醇、 碘酊棉球、75%酒精棉球。 2. 50mL注射器，10ml玻璃离心管、50ml离心管、擦镜纸、 移液枪（枪头）、载玻片、巴氏吸管、镊子等。 3. 显微镜、离心机、
实验五
（一）淋巴细胞分离技术 （二）E玫瑰花环试验
一、实验原理
(一）淋巴细胞的分离：
兔淋巴细胞的方便来源是外周血，此次实验 采用的就是聚蔗糖溶液的密度梯度离心法。外周 血中各种细胞的密度不同，红细胞和多核白细胞 的比重密度较大，1.090左右，淋巴细胞和单核 细胞的密度为1.075～1.090。密度梯度离心法的 原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重 介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心， 使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不 同的独立带，从而达到分离的目的。
SRBC受体(Sheep red blood cell)
T细胞
SRBC
Erythocyte rosette test
红细胞玫瑰花环形成试验
T
B
T
erythrocyte antibody rosette formation test 红细胞抗体玫瑰花 环形成试验
erythrocyte antibody complement rosette formation test 红细胞抗体补体玫 瑰花环形成试验
四、实验步骤
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
详细的淋巴细胞的分离、计数图文教程
<交界液面：一定不要打乱 >
离心 〔200lt;1000rpm,5min> 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与 单核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
细胞计数
本实验：淋巴细胞
实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
数上不数下,数左不数右.
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度〔细胞数/ml>
= 2个大方格内细胞总数
×104×10 <稀释倍数
2
细胞活力检测：〔死细胞被染成蓝色,活细胞不着色
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
稀释的肝素抗凝血,沿管壁轻轻叠加于分离液上, 使两者形成一个清晰地界面.
细胞经离心分层后,缓慢小心吸取,切勿打破形成 的细胞层.
细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系统
自动细胞计数仪
知识回顾 Knowledge Review
T淋巴细胞的分离、计数
XX医学院免疫学教研室
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
T细胞增殖试验
二. 淋巴细胞的功能测定技术
（一）体外法 1．淋巴细胞增殖试验 （1）T细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验） ① T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞转化 染色 计数转化细胞百分率 ② T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞转化 + 3H-TdR 测定cpm值 ③ T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞 + MTT 测定OD值
第二节 淋巴细胞的检测技术
一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分 离 密度梯度离心法
(2000rpm,15min)
(密度为1.077)
(二）淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1.E花环分离法：
人T细胞(表达CD2，即E受体）＋绵羊 红细胞(SRBC) 形成E花环 密度梯 度离心，花环细胞沉降于管底 裂解 SRBC 获纯化T细胞
4.流式细胞术（flow cytometry, FCM）： 荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过 FACS分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter)
流式细胞仪
5.磁珠分离术： (1)直接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞 (2)间接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细 胞 + 抗体 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞
划痕法
② 乳酸脱氢酶(LDH)释放法 靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞) LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸 盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
密度梯度离心法分离淋巴细胞实验原理
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在生物学研究中，密度梯度离心法是一种常用的分离和纯化生物分子或细胞的方法之一。
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离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定
【实验目的】
1.了解离心分离技术的原理与分类。
2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。
【实验原理】
1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。
因此
用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。
2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与
B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。
【实验步骤】
一.细胞分离
1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即
获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。
5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理
盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。
7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm
离心5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后，
可进行细胞类型鉴定。
二.细胞鉴定
1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片
2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量
的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。
【注意事项】
1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成
明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。
2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。
3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。
【实验结果】
如下图：
如图所示，计数出B细胞含量在43%左右。
【实验讨论】
脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。
在脾脏中B淋巴细胞约占55%，根据实验结果，可能是由于操作精确，或染色不许够彻底等因素，导致结果略偏低。