无菌室洁净度检查的要求与方法
无菌实验室及要求与日常管理
无菌实验室的要求与日常管理一、实验室设施开展无菌检查及微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规X》及《药品生产质量管理规X》的要求，建立一个布局合理、使用方便、操作安全的无菌室，并且配有完善的实验设施和管理制度。
无菌检查、微生物限度检查以及接种室（接种对照菌、菌种传代）均应严格分开，具有危险性的毒株、毒素如破伤风梭菌、黄曲霉毒素的实验室需单独使用，以便控制防止传播。
（一）洁净实验室1.洁净室的布局1.1根据样品检验要求，一般应至少包括更衣缓冲系统、微生物限度检查室、无菌检查室、阳性菌室和物流通道。
1.2更衣系统应至少包括一更（含更鞋）、二更（含洗手）、缓冲以及人流走廊等。
1.3物流通道应考虑净污分流的布局，有条件的可设置污物走廊2.1净化级别：洁净走廊、检查室、阳性菌室应为一万级；其他房间应为十万级2.2气流组织：阳性菌室对走廊呈负压，走廊对缓冲有5Pa的正压；阳性菌室全排风2.3电气控制：控制开关外置；设置通讯系统3.结构与要求：无菌洁净室不宜设在底层，防潮、防霉、采光好，远离交通干道，厕所及污染区，面积不超过10m2，高度不超过2.4m，由两个缓冲间、操作间组成。
操作间缓冲间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
无菌室内应六面光滑平整，无缝隙，不起灰，不落尘，耐腐蚀，易清洗，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，操作间不得安装下水道。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，采光面积要大，光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。
缓冲间和操作间应装有紫外线杀菌灯（2－25w/m3）''用于空气消毒。
紫外线波长200－300nm者具有杀菌作用，其中以265－266nm杀菌作用最强，这与DNA的吸收光谱X 围一致，其杀菌机理可能是在细菌细胞DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰细菌细胞DNA复制，导致细菌变异死亡。
紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳，每次开灯照射时间为30min。
GMP-无菌检查操作规程
1.目的：建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。
2.范围：适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。
3.责任：化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。
4.定义：无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。
5.内容：5.1无菌操作设备：无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。
5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。
在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级超净工作台。
缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。
5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。
在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小时。
5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。
取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。
无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100 级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。
5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉及拖鞋等。
5.2仪器、用具：5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。
无菌室的要求标准
无菌室的要求标准洁净室（无菌室）是微生物检测的重要场所与最基本的设施。
它是微生物检测质量保证的重要物质基础。
因此它的设计要按国家标准《洁净厂房设计规范》、国家药品监督管理局颁发的《药品检验所实验室质量管理规范（试行）》中第十八条规定执行。
微生物实验室洁净室的施工、安装、验收应按国家行业标准《洁净室的施工及验收规范》执行。
对于微生物检测工作者和使用管理者来讲，更大量的工作是进行正常管理到日常的使用。
洁净室（无菌室）的标准要符合GMP洁净度标准要求。
洁净室（无菌室）的使用管理要做到以下工作：1.洁净室（无菌室）要符合规范要求：无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。
面积一般不超过10㎡，不小于5㎡；高度不超过2.4m。
由1-2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间和缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。
在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18-26℃，相对湿度45%-65%。
缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。
缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2-2.5w/m³），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40uw/㎡。
不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。
2.建立使用登记制度在登记册中可设置以下项目内容：如使用日期、时间、使用人、设备运行状况、温度、湿度、洁净度状态（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数）、报修原因、报修结果、清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手）、消毒液名称等。
洁净室(无菌室)分级
洁净室（无菌室)洁净室（无菌室）是微生物检测的重要场所和最基本的设施,是微生物检测质量的重要保证。
按洁净厂房设计规范要求设计，并按JGJ71-1990 《洁净室的施工及验收规范》（原JGJ7190废止，更新GB50591-2010 （2011。
2。
1实施)的方法和标准方法执行.分级要求见表我国GMP实施指南提出的级别。
实验室总体布局和各部位的安排应有利于减少潜在的对样本的污染和对人员的危害，实验室应有效控制进入无菌或洁净等特定区域的人员。
应按定期消毒洁净室（无菌室），按洁净室标准监测。
空气洁净级别不同的相邻区间的静压差大于5Pa,洁净室与室外大气的静压差大于10 Pa。
洁净厂房设计规范 GB50073-2001 （部分章节）第一章总则第二章空气洁净度等级第2.0.1条空气洁净度应按表2.0.1规定划分为四个等级。
注:对于空气洁净度为100级的洁净室内大于等于5微米尘粒的计算应进行多次采样.当其多次出现时，方可认为该测试数值是可信的。
2.0。
2条洁净室空气洁净度等级的检验，应以动态条件下测试的尘粒数为依据。
洁净室空气洁净度的测试，应符合附录二规定。
医药工业洁净室（区)悬浮粒子浮游菌和沉降菌的测试方法GB/T16292~16294—1996，已更新为2010版保健食品良好生产规范GB17405-1998网上资料洁净室是一个超级洁净的环境，它不但要控制通风、过滤、温度、湿度、气压以及离子化等，还要同时对环境内的材料和其他参数进行控制。
洁净室的洁净度决定于空气中的悬浮微粒数量，微粒的首要计量单位是微米，即10-6米，大致相当于0。
000039英寸。
洁净室级别划分最为通行使用的方法来自ISO14644标准。
该标准以每立方米空气中0.1微米的微粒来划分洁净室级别，它取代了过去的美国国家标准209—1992（详见表1），而后者是以每立方英尺空气中0.5微米的微粒数来划分洁净级别的。
按照这两个标准规定，209标准中的100级洁净室中每立方英尺空气中大于等于的0。
无菌室技术要求
1、无菌室设计面积为10M2，规格为2.5*4M。
2、无菌室至少有工作间，更衣室和缓冲间三部分，风淋室有或无均可。
3、无菌室必须安装专用传递窗1个和操作台1张，操作台宽度应控制在850MM之间。
4、无菌室内要求安装合乎要求的空调及空气过滤设备，所有进入无菌室的空气都要经过过滤处理，空气洁净度不少于1万级（国家标准），如能达到千级或百级更好。
无菌室内气温在夏季应能控制到小于或等于28度。
5、无菌室内要求安装抽滤设备。
能按照《生活饮用水标准检验法》GB5750-85中滤膜法检验自来水中大肠菌的要求进行操作，并且能同时进行八个水样检验操作。
6、无菌室内须安装足够的照明设备，能保证夜晚也能进行细菌检验操作。
7、无菌室须安装专用紫外线灯。
8、无菌室内地面应作适当处理，以防摩擦起尘。
9、无菌室内不得使用易燃材料装修。
10、无菌室照明灯、紫光灯、空气过滤设备、空调开关都要安装在室外。
而抽滤设备控制开关要安装在室内。
11、无菌室顶的空调及空气过滤器安装必须牢固可靠，以防万无一失。
无菌室是一个微生物检测的重要场所，也是最基础的设施，是检测微生物质量保证的重要物质基础。
无菌室的的标准要符合GMP洁净度的标准要求。
无菌室的要求规范是：无菌室的采光要良好，劲量避免潮湿和原理厕所和污染区，面积一般不超过10平凡米，不小于5平方米，高度不超过2.4米，有一到两个缓冲区，操作间组成。
无菌室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18—26℃，相对湿度45%—65%。
无菌室检查的要求与方法：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。
（1）沉降菌检测方法及标准：以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开平板盖，在空气中暴露30min后将平板盖好，置32.5℃士2.5℃培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数平均小于1个。
无菌室沉降菌测试标准操作规程
无菌室沉降菌测试标准操作规程一、目的：建立无菌室中沉降菌的测试标准操作规程，保证微生物检验在规定洁净级别内进行。
二、范围：无菌室的沉降菌的监测。
三、依据：国家标准GB/T 16294-1996。
四、职责：微生物检验人员对本制度的实施负责。
五、内容1、菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。
通常用个数表示。
2、测试方法：沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经48小时以上培养，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室的洁净度。
3、所用的仪器和设备1）高压灭菌锅锅2）恒温培养箱：必须定期对培养箱进行检定。
3）培养皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿。
使用前将培养皿置于121℃湿热灭菌20分钟。
4、培养基：普通营养琼脂培养基。
将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15m1。
待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入30～35℃恒温培养箱中培养数小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2～8℃的环境中存放。
5、测试步骤1）采样方法：将已制备好的培养皿放置在预先确定的取样点，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上盖后倒置。
2）培养，时间不少于48小时。
每批培养基应有对照试验，检查培养基本身是否污染，可每批选定3只培养皿作对照培养。
3）菌落计数：用肉眼直接计数，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
6、注意事项1）测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
2）采取一切措施防止人为对样本的污染。
3）对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
微生物检验无菌室洁净标准及其操作规程
微生物检验无菌室洁净标准及其操作规程无菌室(洁净室)是微生物检验室的核心。
无菌室普通是在微生物试验室内开拓的一个自立小房间。
无菌室的规划设计、建设要符合《洁净室施工及验收规范》(GB50591-2010)的要求。
(一)无菌室洁净标准无菌操作间洁净度应达到10000级，超净工作负清净度应达到100级，室内温度维持在18～27℃，湿度保持在30%～70%。
详细要求见表4-3。
表4-3 无菌室(洁净室)空气洁净度级别注：1.浮游菌m3和沉降菌/皿可任测一种。
2.100级洁净室(区)0.8m高工作区的截面最低风速：垂直单向流0.25m/s，水平单向流0.35m/s。
(二)无菌室操作规程 (1)无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。
(2)无菌室应定期用相宜的消毒液灭菌清洁，以保证洁净度符合要求。
按照无菌室的净化状况和空气中含有的杂菌种类，可采纳不同的消毒剂，如、、、3%气溶胶喷雾(20mL/m3)、(配成1%浓度喷洒)、5%气溶胶喷雾(2.5mL/m2)等。
(3)工作人员进入无菌室前，必需用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服、鞋、帽子、口罩和手套。
(4)无菌室用法前，应将全部物品置于操作部位(待检物除外)，然后打开紫外灯杀菌30min以上，并同时打开超净工作台举行吹风。
操作完毕，应准时清理无菌室，再打开紫外灯灭菌20min。
(5)凡带有活菌的物品，必需经高压灭菌后才干清洗或丢弃。
(6)每2～3周用3%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌椅及地面。
(7)无菌室应每月检查菌落数。
在超净工作台开启的状态下，取内径90mm的养分琼脂平板3～5个，分离放置在工作位置的左、中、右等处，开盖裸露30min后，倒置于30～35℃培养箱内培养48h，取出检查。
100级洁净室平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级洁净室平板杂菌数平均不得超过3个菌落。
如超过限度，应对无菌室举行彻底消毒，直至重复检查合乎要求为止。
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
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无菌室洁净度检查的要求与方法
作者:常州乐道于2011-07-26 11:07:36 发表只看该作者
无菌室在消毒处理后, 无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数, 以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度,常有沉降菌和浮游菌测定方法。
（1 沉降菌检测方法及标准:以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室,在操作区台面左、中、右各放1 个;打开平板盖,在空气中暴露30min 后将平板盖好, 置325C 士2.5C培养48h取出检查,3个平板上生长的菌落数平均小于1个。
（2 浮游菌检测方法及标准:用专门的采样器,宜采用撞击法机制的采样器,一般采用狭缝式或离心式采样器,并配有流量计和定时器,严格按仪器说明书的要求操作并定时校检, 采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌, 使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。
使用时,先开动真空泵抽气,时间不少于5min ,调节流量、转盘、转速。
关闭真空泵,放入培养皿,盖上采样器盖子后调节缝隙高度。
置采样口采样点后,依次开启采样器、真空泵,转动定时器,根据采样量设定采样时间。
全部采样结束后,将培养皿置32.5C 士2.5培养48h，取出检查，浮游菌落数平均不得超过5个/m3。
每批培养基应选定3 只培养皿做对照培养。
无菌操作台面或超净工作台还应定期检测其悬浮粒子, 应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪检测,并根据无菌状况必要时置换过滤器。
定期进行洁净度再验证:定期（每季度、半年、1 年或当无菌室设施发生重大改变时,要按国家标准GB/T16292-16294-1996《医药工业无菌室（区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行洁净度再验证,以确保洁净度符合规定,保存验证原始记录,定期归档保存, 并将验证结果记录在无菌室使用登记册上, 作为实验环境原始依据及趋势分析资料。
并定期对无菌室的环境检测数据进行趋势分析和评估, 根据评估结果, 了解无菌室设施环境质量的稳定状况及变化趋势,决定是否有必要修订相应的警戒和纠偏限度。
定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的初效、中效、高效头:定期（至少每年1次更换新的紫外灯管, 以确保紫外灯管灭菌持续有效。
并同时在使用登记本上做好更换记录, 定期归档保存。
至少2年1次,或按无菌室验证实际情况,定期更换初效、中效、高效头。
以确保净化系统的功能持续有效,并同时在使用登记本上做好更换记录,定期归档保存。
使用过程中应尽可能减少人员的走动或活动:平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动, 同向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
洁净度不符合规定时立即停止使用:发现洁净度不符合规定时, 应立即停止使用寻找原因, 彻底清洁、必须经洁净度再验证符合规定后, 才再使用, 并同时将情况记录在无菌室使用登记册上,定期归档保存。
对进入的外来人员或维修人员进行指导和监督:非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室,对必须进入的外来人员或维修人员要进行指导和监督。
洁净室（无菌室的日常管理:建立安全卫生值日制度, 一旦发现通风系统、墙壁、天花板、地面、门窗及公用介质系统等设施有损坏现象, 要及时报告并采取相应的修复措施, 并保存记录及时归档。
从洁净室（无菌室环境中检测到的微生物应能鉴别至属或种, 保留鉴别实验原始记录及菌种, 作为无菌生产、无菌检查无菌室环境质量、消毒剂有效性评估及污染源调查的依据,并且也是为无菌检查阳性结果的调查提供第一手资料。