转基因植物及其产品的检测方法
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
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Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
转基因植物的生产和检测方法
转基因植物的生产和检测方法转基因植物是繁殖用于人类消费的农作物，其基因被修改以抵御虫害和提高产量。
转基因的技术对世界的食品安全、环境保护和农业产量增加产生了重要的影响。
但是，随着转基因产品的不断推广和应用，对于检测其是否安全和透明的要求也越来越高。
本文将介绍转基因植物的生产和检测方法。
一、转基因植物的生产方法转基因植物的生产方法主要分为两种，一种是基因枪法，另一种是农杆菌介导的转基因法。
基因枪法是通过射入改造后的DNA 直接向植物细胞内导入外来基因，从而实现转基因植物的创建。
而农杆菌介导的转基因法则是通过把拥有外来基因的细菌注入植物细胞内，再将细菌注入特定的细胞壁，使得外来基因稳定地嵌入植物的基因组中。
当然，在此基础上，科学家还使用了一些远离传统种植法的技术，例如如基因编辑工具CRISPR-Cas9。
基于如此多样化的转基因生产方法，科学家们已经可以创造出各种不同类型的转基因植物。
二、转基因植物的检测方法转基因植物的检测方法主要包括了两类：一是用于提取DNA的样品，二是用于检测的样品。
在前人研究的基础上，当前有两种常见检测方法：PCR和ELISA。
PCR(聚合酶链反应)是目前主流的转基因检测技术，它能够根据材料提取的DNA进行基因片段扩增，从而检测模板所对应的基因是否存在。
PCR技术以灵敏度、特异性高、复查和修复能力强著称，不过，PCR技术存在可能会观察到错误反应的问题。
另外一个常见的检测技术是酶联免疫吸附法(ELISA)，它特别适用于筛查含水量较低的复合样品。
ELISA是一种抗体检测技术，它基于抗体结合了基因，在测试物接口中发生颜色反应，显示基因存在或不存在。
这种方法也常用于通过检测植物组织中蛋白质水平的方法来检测转基因。
总之，用于转基因检测的技术越来越精准和可靠，从而让我们可以安心地使用和消费转基因植物农作物。
同时，也可以使用这些技术来帮助农民更好地掌握农田信息，从而进一步提高农产品的营养价值和商品价值。
NYT-1103.2-2006-仅供参考
NYT 1103中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.2－2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定Safety assessment of genetically modified plant and derived products Part 2: assay of anti-nutrients pancreatic typsin inhibiter2006-07-10公布2006-10-01实施中华人民共和国农业部公布前言本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国农业转基因生物安全治理标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：中国疾病预防操纵中心营养与食品安全所、农业部科技进展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。
本标准首次公布。
转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定1 范畴本标准规定了转基因植物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定方法。
本标准适用于转基因大豆及其产品、转基因谷物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定。
其他的转基因植物，如花生、马铃薯等也可用该方法进行测定。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
2.1转基因植物genetically modified plant指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的植物。
2.2转基因植物产品products derived from genetically modified plant 指转基因植物的直截了当加工产品和含有转基因植物的产品。
3 原理胰蛋白酶可作用于苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPA），开释出黄色的对硝基苯胺，该物质在410 nm下有最大吸取值。
转基因植物及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。
用分光光度计在410 nm处测定吸光度值的变化，可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。
4 试验材料转基因植物及其产品、受体植物及其产品。
主要转基因植物及其产品的PCR检测方法研究的开题报告
主要转基因植物及其产品的PCR检测方法研究的开题报告一、背景与意义随着生物技术的不断发展，转基因技术已经在农业生产中广泛应用。
而随之而来的问题是，转基因食品对人体健康及环境造成的影响是什么，消费者对转基因食品的安全性和可信度持怀疑态度。
因此，建立快速、准确、灵敏、稳定的转基因检测方法是保障食品安全、维护消费者权益的必要手段。
PCR技术作为一种传统和广泛应用的转基因检测方法，在转基因检测领域中占据重要地位。
本文旨在探讨主要转基因植物及其产品的PCR检测方法研究。
二、国内外研究现状目前，转基因检测方法主要分为两类：基于DNA检测的方法和基于蛋白质检测的方法。
其中，基于DNA检测的方法又可分为PCR、电泳、荧光定量PCR、实时荧光PCR、引物免疫层析、微纳装置等多种方法。
目前国内外主要的转基因检测技术为PCR方法，包括对加入商业化大量出产的转基因植株和转基因细胞系进行PCR检测，对转基因种子、转基因食品和转基因兽药进行PCR检测。
PCR方法不仅具有检测速度快、检测结果准确、检验灵敏度高等优点，而且操作简便、成本低廉。
三、研究内容和方法本文将就主要转基因植物及其产品的PCR检测方法进行研究，以具体的研究方法为目标，包括以下几方面内容：1. 转基因检测样品的采集和处理方法；2. PCR反应原理及扩增条件的优化；3. 转基因检测引物的设计与优化；4. PCR产物的检测方法及数据分析；5. 转基因检测方法的验证与评价。
四、预期成果本研究将建立一套可行的转基因检测方法，对主要转基因植物及其产品进行准确、快速、高效的检测；优化PCR反应条件，提高PCR扩增的灵敏度和特异性；开发适合转基因检测的引物，提高测试效率和精度；验证和评价PCR检测方法的可靠性和稳定性，为转基因检测技术的标准化提供参考。
转基因食品的检测方法材料
转基因食品的检测方法自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。
但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。
许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。
我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。
世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。
因此转基因产品的检测就显得尤为重要。
转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。
本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。
1核酸水平主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。
椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。
核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。
1．1定性检测1．1．1聚合酶链式反应(PCR)1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。
利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。
Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。
转基因作物安全评价的检测技术
中 图分 类 号 ：Ｑ ８ １ ９ 文 献 标 志 码 ：Ａ
转 基 因作物 商业化 种植 始于 １ ９ ９ ６年 ， 截至 ２ ０ １ ３年 ， 其 种植 面积 已增 长 了 １ ０ ０倍 ， 全球 ３ Ｏ多个 国家数 百 万农 民种 植 了转 基 因作物 Ｊ ， 许 多重 要 的农 作 物 如 玉米 、 土豆、 水稻、 小麦 、 大豆 、 烟草 、 番茄 、 棉 花 等都
转 基 因作 物 安全 评 价 的检 测 技 术
易 小平 ， 谭 燕华 ， 彭存 智 ， 谢 翔 ， 贺 萍 萍
（ 中 国热 带 农 业 科 学 院 热 带 生 物 技 术 研 究 所／ 农 业 部 转 基 因植 物 及 植 物 用 微 生 物 环 境 安 全 监 督 检 测 中心 ， 海南 海 口 ， ５ ７ １ １ ０ １ ）
全评 价 ， 而 转基 因作 物 的检 测技 术是 安 全性 评 价 的关 键 。基 于 Ｄ Ｎ Ａ 和蛋 白质 的不 同 的检 测方 法 已用 于
转基 因作物 及其 产 品的检测 。近年来 新 的检验 检测方 法不 断 涌现 ， 各 种新 的检测 技术 也 被应 用 到转 基
因检测中， 如特定 Ｄ Ｎ Ａ的 Ｐ Ｃ Ｒ扩增检测技术、 外源蛋 白检测技术等。转基因作物的安全性评价包括两个 方面， 即对 环境 影 响的安全 评价 和对 人 类 与动 物影 响 的安全 评 价 。 目前 ， 国际 通用 的转 基 因作 物 的安 全 性评 价 的指 导性 原则 是实 质等 同性原 则 （ ｓ ｕ ｂ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ ａ ｌ ｅ ｑ ｕ ｉ ｖ ａ ｌ ｅ ｎ ｃ ｅ ） 。根据 实质等 同性 原则 ， 与转 基 因作物 相 对应 的非转 基 因作物 由于 有长期 的食 用历 史 ， 因而被 认 为是 安全 的。 已商业 化 的转 基 因作 物进 行 安全 性
实验3：农作物转基因成分检测
实验三农作物转基因成份的检测---- PCR方法检测Bt玉米的外源基因实验目的：掌握CTAB法从转基因植物叶片提取DNA的原理和方法；掌握PCR扩增DNA的技术及原理，学习PCR的操作及PCR扩增仪的使用。
实验内容:1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2、PCR检测转基因植物外源基因(启动子序列)，扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳检测。
实验仪器设备、试剂等用品仪器设备用品：恒温水浴锅，离心机，FastPrep细胞破碎仪，移液枪，离心管，吸头，电泳仪，电泳槽，PCR扩增仪试剂：CTAB，氯仿，异戊醇，无水乙醇，异丙醇，β-巯基乙醇，PCR试剂盒，引物(primer)第一部分植物基因组DNA的提取原理：CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。
核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA 制品。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。
转基因植物的检测策略和检测技术
艋 扬 镰靠 第 ３ 卷第 １ ２０ ） ３ 期（０７
诧鸯
Ｐ Ａ Ｒ Ｌ ＮＴ Ｐ ＯＴＥ Ｔ ＯＮ Ｖｏ． ３Ｎｏ １ （ ０ ７ Ｃ Ｉ １３ ． ２ ０ ）
张 莹 ， 张永军 ， 吴孔 明 ， 赵奎军 彭于发 郭 予元 ， ，
制 ＧＭＯ 的进 口。我 国于 ２０ ｓ ０１年 ５月 ２ ３日颁 布农 业转基 因生物安 全 管理 条例 ，０２年 ３月 ２ ２０ ０日开 始 实行 的《 农业 转基 因生物 标识 管理 办法 》 规定 ， 国家 对 农业转 基 因生物 实行检验 检疫和 标识 制度 ， 凡是在 中 国境 内销售 的 大豆 、 玉米 及 其制 品若属 转 基 因生 物 ， 必 须进行标识 。由于食 品标 识 以及食 品制 造商 、 销售 商、 消费者等 多方 面 需要 ， 转基 因食 品 与常 规食 品 将 区别开 ， 迫切需 要一套可 行 的检 测方 法 以满足社 会需
ｂｌｇｏ ｅＧ ｓ ｎ ｓｒ ｕａｔｒ ｅｎ ｆ ＭＯ ｄｉ ｉ ｈ ｔ ａ ｔ ｍｎｆｃ ￣ ｕ
Ｔ ｒｔ ｔ ｃｎｍｉｂｎｆｓ ｉｉ ｎ ．ａｙｆｒｔ ｍ ｐｏｅｔｅｒ ｅｒｈｏ ｏ ｐｏｅ ｏｏ ｃ ｅｅ ｔ，ｔｓ ￣． ｒ ｅ ｔ ｉ ｒ ｅ ａｃ ｎ ｃｅ ｉ ｓ ｓ ｏｈ Ｏｍ ｖ ｈ ｓ
ＣＶ ｓ ｅ ｃ ｏ ．Ｓ ｒ ｔｅｅ ｅ ｗ ａ ｒ ｔ ￣ ｉ Ｇ Ａ ｌ ｔ ｔ ｎ ｏｆ ， ｒ ｏｍ ｊ ｌ Ｏ ｄ ｅｉ ａ ｈ ｒ ａ ｔ ｏ ｍｅ ｘ ｎ Ｍ０ ｅ ｔ ｎ ｉ ｌ ｉ ｏｈＤ Ａ ｄ ｐ ｔ ｎｄ ｔ ｔ ｎ ｄｔ ｉ ， ｃ ｄ ｇ ｂ ｔ Ｎ ａ ｒ ｅ ｅｉ ． ｃ ｅ ｏ ｎ ｕｏ ｎ ｏ ｉｅ ｃ ｏ
多个， 由转基因作物产品加工的转基因食品和食 品成 分达 ４ ０ 余种 。全球转基因产品占该作物种植面积 ０ ０ 的比例从大到小依次为 ： 大豆、 棉花、 玉米 、 油菜。然 而 ， 因作物在带来 巨大效 益 的同时也 潜在 许 多问 转基
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– gus基因 – 萤光素酶 – gfp基因
NanoLuc™ 萤光素酶
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转基因植物检测 ---外源基因表达产物的检测
免疫学检测法： – ELISA： – 试剂条检测： – Western blot：
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转基因植物检测依据
报告基因：
通过报告基因在转化植株中的瞬时表达和稳定表达可以确定外源基因是否能在 转化细胞中表达。
cat：氯霉素乙酰转移酶基因
CAT活性通过硅胶G薄层层细及DTNB分光光度法测定
gus：β-葡萄糖苷酸酶基因
GUS可催化底物X-Gluc水解产生蓝色沉淀反应和4-MUG 水解发荧光（λ=455nm）
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转基因植物检测---外源基因检测
PCR检测：
– 常规PCR – 多重PCR – 巢式PCR – 实时荧光定量PCR – PCR-ELISA – PCR-genescan
核酸杂交检测
– 印记杂交 – 斑点杂交 – 细胞原位杂交
基因芯片技术
– GMO芯片试剂盒
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转基因植物检测 ---外源基因表达产物的检测
gfp：绿色荧光蛋白基因
在395nm光激发下可产生绿色荧光。
luc：萤光素酶基因 ant：花青素基因
在转化植物组织上生成红色的花青素斑点。
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ห้องสมุดไป่ตู้
转基因植物检测依据
表现性定性分析
表性分析可通过测定某一特定的性状存在与否，来判断 是否为转基因植物。目前，能测定的性状是对除草剂是 否有抗性。用于GMO种子检测。
定性及定量
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转基因植物检测依据
启动子、目的基因、终止子；选择标记基因 • 启动子：CaMV 35s和土壤农杆菌的nos启动子 • 终止子：土壤农杆菌的nos终止子 • 目的基因：近百种 • 选择标记基因：
✓ 抗生素抗性基因：新霉素磷酸转移酶基因npt-Ⅱ/潮霉素磷酸转移酶hpt ✓ 除草剂抗性基因：bar基因和als基因
转基因植物 及其产品的检测方法
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转基因植物（GMO）
• 自1983年首例转基因植物问世以来，其商业化种植面积和经济效益迅速扩大。 ✓ 提高农产品产量、品质 ✓ 提高植物对生物和非生物胁迫的抗性
• 转基因植物及其食品的生物安全性 ✓ 对环境的影响及生态效应 ✓ 食品的安全性
• 转基因植物及产品的检测