荧光原位杂交仪实验报告
荧光原位杂交技术
硕士学位论文荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in thefield of environment作者姓名：**学科、专业：环境科学与工程学号：********指导教师：***完成日期：2014/3/26XX理工大学Dalian University of Technology摘要荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。
总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。
利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。
并且展望了FISH技术的未来。
关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH）isa new technologywhich is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH.Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but alsoanalyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the futureof FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring目录摘要IAbstractII1 荧光原位杂交技术简介41.1 FISH发展历史41.2 FISH原理51.3 FISH基本过程61.3.1 探针制备61.3.2 探针的标记71.3.3杂交前处理71.3.4 杂交81.3.5荧光检测与结果分析91.4 FISH技术特点101.5 常见的技术问题及解决措施101.5.1 FISH检测的假阳性101.5.2 FISH检测的假阴性112 FISH技术在环境领域的应用112.1 对硝化细菌的监测112.2 对除磷细菌的监测122.3 FISH技术在丝状微生物研究中的应用122.4 对厌氧颗粒污泥中微生物的监测132.5 对自然环境中微生物多样性的监测133 未来展望14参考文献151荧光原位杂交技术简介荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
原位杂交实验总结
定价协议书甲方（供应商）：_____________________乙方（采购方）：_____________________鉴于甲方是专业的产品供应商，乙方有采购该产品的需求，双方本着平等自愿、诚实信用的原则，就产品定价事宜达成如下协议：1. 产品信息：甲方同意向乙方提供以下产品，具体产品信息如下：产品名称：________________型号/规格：________________单位：________________质量标准：________________2. 定价机制：双方同意按照以下方式确定产品价格：a. 固定价格：双方约定在合同有效期内，产品价格为固定价格，不随市场波动而变化。
b. 浮动价格：若双方同意，产品价格可以根据市场行情进行调整，具体调整机制如下：i. 价格调整周期：________________ii. 价格调整依据：________________iii. 价格调整通知：甲方应至少提前____天书面通知乙方价格调整事宜。
3. 价格条款：产品价格包括以下费用：a. 生产成本b. 运输费用c. 税费d. 其他双方约定的费用4. 付款方式：乙方应在收到甲方发票后____天内，按照约定的价格条款支付货款。
5. 价格保密：双方应对本协议中的价格信息保密，未经对方书面同意，不得向第三方透露。
6. 协议期限：本定价协议书自____年____月____日起至____年____月____日止有效。
7. 违约责任：如一方违反本协议约定，应向守约方支付违约金，违约金的数额为违约方应支付或应收款项的____%。
8. 争议解决：双方因履行本协议所发生的任何争议，应首先通过友好协商解决；协商不成的，提交甲方所在地人民法院诉讼解决。
9. 其他约定：________________甲方代表（签字）：_____________________乙方代表（签字）：_____________________签订日期：____年____月____日签订地点：_______________________________（注：本协议书模板仅供参考，具体条款应根据实际情况由双方协商确定。
植物显微技术实验报告
实验一利用流动细胞仪测定植物DNA含量一、实验目的1、了解流动细胞仪的基本构造、原理与应用。
2、熟悉流动细胞仪的基本操作。
3、学会流动细胞仪样品制备及结果处理。
二、实验原理单个细胞、细胞群或其他生物微粒经过特异的荧光染料染色（DAPI或PI或免疫荧光标记）之后，在气体压力下，通过样品管引入到喷嘴内形成样品流，样品流经过激光束（488、405等）照射，样品流中的细胞吸收光能后发射出荧光，然后经相应的检测器检测，检测结果以直方图、二维散点图或三维立体图的形式显示出来。
根据荧光强度与胞内生物大分子含量的比例关系，对细胞进行定量分析。
三、实验步骤1、从野外取新鲜幼嫩的叶片（或竹笋）。
2、将新鲜的叶片（或竹笋）切取1平方厘米大小，放进干净玻璃培养皿中。
3、加入500μL PARTEC公司流式细胞仪自带的cystain UV precise P Nuclei Extraction Buffer 滴于样品上。
4、用双面刀片将样品剁碎，核提取2-3分钟。
5、然后再加入2mL 仪器自带的cystain UV precise P stain Buffer进行细胞核染色4分钟。
6、利用移液枪吸取染色后的样品，经公司自带的滤膜过滤到5mL的测量管中，进行测量。
四、实验结果水稻平均峰值25.25，用所测竹种的数值除以水稻平均峰值25.25就是该竹种的DNA含量所对应的DNA含量。
水稻（2C=1pg）获得类似下图结果白纹阴阳竹平均峰值为(104.71+108.5+109.37)/3=107.53白纹阴阳竹DNA含量：2C=107.53÷25.25×1pg=4.26pg实验二石蜡切片技术一、实验目的在有关植物胚胎发育和组织器官的形态建成研究的过程中，都需要应用到石蜡切片技术。
在植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别，以及林木材性鉴别等方面的研究和教学工作中，由于各作物器官的性质差异以及研究目的的不同，就需要用不同的制片方法。
原位杂交实验
荧光原位杂交（FISH）的实验步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
荧光原位杂交技术检测BCR-ABL融合基因阳性的病例分析
荧光原位杂交技术检测BCR-ABL融合基因阳性的病例分析荧光原位杂交技术（FISH）是一种能够检测基因染色体异常的分子遗传学技术，广泛应用于血液学、肿瘤学等多个领域中。
本文以一名患有慢性髓细胞白血病（CML）的患者为例，阐述荧光原位杂交技术检测BCR-ABL融合基因阳性的过程及结果。
患者，男性，65岁。
因口渴、口干、腰疼等症状就诊于本院。
经常规检查发现白细胞计数为40×10^9/L，骨髓形态学示慢性期CML。
接下来，为了确定患者CML的分子遗传学变异情况，选择了荧光原位杂交技术检测BCR-ABL融合基因。
实验流程如下：首先，从患者血样中提取细胞，并通过离心等处理步骤，制备出细胞悬液。
接着，使用一系列合成的荧光探针，与细胞DNA序列发生特异性结合。
該荧光探针包含Fusion Green（FG）和Fusion Orange（FO）荧光染料，分别用于标记BCR基因和ABL基因。
如果细胞存在BCR-ABL融合基因，那么BCR基因和ABL基因就能形成连接，使荧光探针结合并显示出光信号。
如果细胞没有BCR-ABL融合基因，则FO和FG的信号不会同时出现。
实验结果显示，患者细胞核内同时能够检测到FO和FG信号，且两种信号位置重合，说明患者BCR基因和ABL基因融合。
进一步分析结果，患者的融合基因区域是t（9；22）（q34;q11.2），合成了BCR-ABL融合基因。
依据患者荧光原位杂交技术检测结果，制定了治疗方案，包括干细胞移植和靶向治疗等。
通过定期监测患者血象和病理学表现等指标，发现患者的CML得到了有效控制。
总之，荧光原位杂交技术可以高度特异地检测基因染色体异常，是CML等恶性肿瘤分子遗传学诊断和疗效监测的重要技术手段。
在临床检查中，可以辅助医生诊断和制定个性化的治疗方案，从而提高患者的生存质量和治疗效果。
ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案
地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。
（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。
）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。
（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。
（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。
杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。
杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。
加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。
注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。
荧光原位杂交检测报告
荧光原位杂交检测报告
一、检测目的
本次检测旨在探究目标基因在细胞核内的位置以及其存在的数量，以确保基因研究可靠性及准确性。
二、检测方法
采用荧光原位杂交技术（FISH）进行检测。
首先，获取样本组织切片并制备。
然后，利用荧光信号染色体常规核型分析技术，将采集的细胞进行体外细胞培养，用血白进行标本制备，完成荧光原位杂交，最后在荧光显微镜下观察目标基因信号。
三、检测结果
本次检测结果显示：目标基因存在于细胞核的特定区域且数量适当，未出现缺失或多余现象。
具体细节如下：
1. 细胞核内目标基因存在的数量为正常情况下的1个；
2. 目标基因位于常染色体的20号染色体的长臂上；
3. 目标基因信号强度适中，无杂乱信号干扰；
4. 目标基因存在于所有观察到的核中，未出现缺失现象。
四、检测结论
本次荧光原位杂交检测结果显示目标基因存在于样本组织细胞核内且数量适当，位置确定，验证了该基因在实验研究中的可靠性和准确性。
鉴于本次检测结果，应确保实验人员、化学品、仪器设备、试卡等相关实验材料的检测标准及操作规范，提高实验质量及结果准确率。
五、附注
1. 此次检测的基因为【填写基因名称】；
2. 本次检测结果仅供参考，如需获取更多相关信息或进一步检测，请再次联系本实验室。
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荧光原位杂交仪实验报告
实验者：魏兰兰
实验时间：2016/10/18—2016/10/19
一、实验目的
1．探针试剂吸液量定量—10ul；
2．观察探针试剂滴液时是否有残留；
3．观察探针试剂滴液后盖板是否能压紧，是否均匀摊开，石蜡是否能完全浸裹；
4．观察上一步试剂对探针试剂有无影响；
5．观察探针试剂对下一步试剂有无影响；
6．观察37℃恒温16小时后，探针试剂是否挥发；
二、实验器材
1．荧光原位杂交仪
2．10ul取样器
3．一次性枪头
4．探针试剂（墨水稀释液）
三、实验步骤
1．10ul定量：利用10ul取样器确定一次性枪头吸液10ul液面所在的刻度位置，经过多次调整杂交仪柱塞泵电机的吸液步数，最终确定电机的吸液步数为1920时，吸液量恰好是10ul。
2．对反应池1运行以下程序步骤以确定实验目的的2.3.4.6项：
3．对反应池2、5运行以下程序步骤以确定实验目的的2.3.5.6项：
四、实验结果
1．本实验3次吸探针试剂量均在10ul刻度线处；
2．本实验3次滴探针试剂时基本没有残留；
3．本实验3次滴探针试剂后盖板均能压紧，目测无缝隙，石蜡完全
浸裹；
4．反应池1、5的上一步试剂均排液排尽，对探针没有其他影响；
5．反应池2因上一步（二甲苯试剂）排液时恰在中间位置残留大约50ul试剂，导致探针试剂压紧后溢出到盖板外1/4-1/3的液量；
6．由于探针试剂用到石蜡覆盖，排液时石蜡不能完成排尽，故而下一步试剂上还会有部分石蜡覆盖，除此之外无其他影响；
7．反应池1、5经过37℃恒温16小时后，探针试剂基本无挥发且成均匀摊开状；反应池2经过37℃恒温16小时后，探针试剂挥发1/2左右（因有溢出）基本成均匀摊开状。
8．盖板掀开后探针试剂表面有石蜡油，一种可能是实验中扩散到盖板内覆盖探针试剂，另一种可能是盖板掀开后扩散探针试剂表面。