荧光原位杂交更新
荧光原位杂交技术的临床应用_概述及说明
荧光原位杂交技术的临床应用概述及说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以通过使用荧光探针与待测DNA序列特异性结合，实现对目标DNA的检测和定位。
该技术的广泛应用使其成为基因诊断、细胞生物学以及遗传学研究的关键工具。
本文将对荧光原位杂交技术进行全面概述，并讨论其在临床诊断和生命科学研究中的重要应用。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行介绍和讨论：首先，我们将简要介绍荧光原位杂交技术的基本原理和相关概念；接着，我们将详细阐述该技术在临床诊断中的应用，包括癌症相关染色体异常的检测与定位、遗传疾病的分子诊断与遗传咨询以及微生物检测和感染性疾病的诊断；然后，我们将探讨该技术在生命科学研究领域中的重要应用，包括基因组和染色体结构分析、基因表达调控机制研究以及细胞核内事件及细胞过程动态观察与实时监测；最后，我们将对荧光原位杂交技术进行总结和评价，并展望其未来发展趋势。
1.3 目的本文的目的是全面概述荧光原位杂交技术的临床应用，并介绍该技术在生命科学研究中的重要性。
通过阐述其基本原理和应用案例，旨在增进读者对该技术的了解，并为相关领域的研究人员提供指导和启示。
同时，我们还将对该技术的优势和局限性进行评价，以便读者更好地理解并运用荧光原位杂交技术。
2. 荧光原位杂交技术概述2.1 原位杂交技术简介荧光原位杂交技术是一种用于分析染色体、基因组和RNA等核酸序列的强有力的方法。
它基于亲和性结合原理，利用荧光标记的探针与待测样品中的靶序列进行特异性杂交，通过可见光或荧光显微镜观察探针与样品是否杂交成功，从而实现对目标序列的定位和检测。
2.2 荧光原位杂交技术的基本原理荧光原位杂交技术主要包括以下几个步骤：首先，利用DNA合成或PCR扩增方法得到所需的荧光标记探针；然后，通过氨基化反应将这些探针连接到具有亲和性活性分子（如尾牙肌动蛋白）上，形成完整的荧光标记探针；接下来，在待测样品上进行脱氧核苷酸（dNTP）逆转录DNA合成反应，并在此过程中引入树酰胺（digoxigenin）－标记或生物素－标记dUTP等标记探针；然后，对样品进行固定处理，并与探针进行杂交，使探针与样品中的互补序列结合；最后，利用可见光或荧光显微镜观察并分析杂交信号，实现对目标序列的检测和定位。
荧光原位杂交
荧光原位杂交
染色体涂染探针
人类染色体结构分析
荧光原位杂交
染色体涂染探针：染色体结构异常分
析ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
荧光原位杂交
多色复合染色体 FISH探针
多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex
• 与之比FISH的优点 • ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,
而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 上的误 差等。
荧光原位杂交技术的研究进展
荧光原位杂交技术的研究进展何世斌;柴连琴;谭珺隽;沈尧;周萍;马云峰;李立家【摘要】荧光原位杂交(FISH)是在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段.近年来,围绕提高检测的分辨率和灵敏性,不断将免疫染色、量子点和微流控芯片等物理化学技术引入到荧光原位杂交中,促进了它的快速发展.本文主要综述了荧光原位杂交的基本原理和发展历程,重点介绍了免疫染色-荧光原位杂交(immuno-FISH)、量子点-荧光原位杂交(QD-FISH)和微流控芯片-荧光原位杂交(FISH on microchip)等多种新技术及其检测特点,如快速、灵敏、动态、多样化等.随着荧光原位杂交技术的不断完善与发展,将在细胞遗传学、表观遗传学及分子生物学等领域发挥更加重要的作用.【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2014(032)002【总页数】6页(P199-204)【关键词】荧光原位杂交;免疫染色;量子点;微流控芯片【作者】何世斌;柴连琴;谭珺隽;沈尧;周萍;马云峰;李立家【作者单位】河南大学生命科学学院,河南开封475004;河南大学生命科学学院,河南开封475004;武汉大学生命科学学院,武汉430072;河南大学生命科学学院,河南开封475004;河南大学生命科学学院,河南开封475004;河南大学生命科学学院,河南开封475004;武汉大学生命科学学院,武汉430072【正文语种】中文【中图分类】Q343分子细胞遗传学的发展为宏观细胞学和微观分子生物学的研究架起了一座桥梁。
早期细胞遗传学的研究是建立在细胞核和染色体基本特征上的，如染色体的长短、臂比、着丝粒、端粒、核仁组织区等，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)的出现标志着分子细胞遗传学一个重要阶段的开始。
近年来，随着物理、化学技术的发展与进步，免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中，促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
荧光原位杂交技术的现状与未来
荧光原位杂交技术的现状与未来作者：王水兵李想来源：《大经贸·创业圈》2019年第10期【摘要】荧光原位杂交技术是近30多年不断发展起来的一种改变细胞遗传学研究方式的技术，它基于碱基互补配对原则，使用被荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态信息。
未来的FISH技术也将结合“芯片实验室”微流控芯片技术与自动化FISH检测设备，将极大地拓展荧光原位杂交技术的应用。
本文主要讨论了FISH技术的技术特点进行总结，以及综述了近年来的主要技术进展和应用情况。
【关键词】荧光原位杂交技术现状应用前景一、荧光原位杂交技术及标记物的选择在FISH技术未成熟之前，放射性核素探针被常用于检测染色体DNA基因是否发生突变，由于放射性核素探针法操作复杂、探针不稳定、且涉及放射性同位素，同位素标记法一直没有得到有效的进展。
随后FISH技术日益成熟，也广泛用于医学细胞诊断中，相对于前者来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、干扰信号少，通过一张玻片可以标记多种颜色探针等优点。
在FISH技术中，荧光标记物作为一个重要的载体在医学诊断、药物筛选等领域有着广泛的应用。
人们利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选。
在科研和临床试验中，荧光染料基本涉及从紫外光、可见光、红外等整个光谱。
由于灵敏度高，操作方便的荧光染料，渐渐取代了放射性同位素作为标记物，广泛应用于荧光免疫、探针以及细胞染色等。
例如，我们常见的核酸染料，可作为背景对照，诸如我们常见的DAPI就是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。
荧光探针标记物有荧光染料、生物素、稀土金属等类别。
其中，生物素与其他荧光标记物相比，具有安全可靠、价格低廉等优点。
二、荧光标记技术与方法荧光探针标记物技术有缺口平移标记法、PCR标记法、DNA纤维技术等多种方法。
采取的技术有多元荧光原位杂交技术、比较基因组杂交技术等技术。
荧光原位杂交技术及其在植物学中的应用现状
荧光原位杂交技术及其在植物学中的应用现状荧光原位杂交是Langer在1982由原位杂交改善而来[1]，其基本原理为：根据核苷酸碱基互补配对原则，使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交，然后用合适的检测方法将荧光信号检出，达到基因定位的目的。
因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。
自从1985年Raybm[2]首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。
1 荧光原位杂交技术的发展与改进荧光原位杂交是在放射性同位素原位杂交的基础上改进而来的，Manning等[3]在1975年最早用非放射性的生物素通过细胞色素C与RNA分子链接，开创了非放射性标记，Rudkin等1977年在放射性同位素标记的基础上发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术，Langer等在1982年成功地实现了首例用生物素标记探针的原位杂交，自此荧光原位杂交技术真正建立并不断发展改进。
随着分子生物学技术的发展，FISH技术还衍生出了引物原位标记、间期核FISH、染色体原位抑制技术等，并且还发展出M- FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH 以及近年来微阵列技术等这些更为完善的FISH技术。
1.1 FISH中探针的发展改进特异探针序列的正确选择是FISH技术中的一个关键，随着FISH技术发展，针对不同的研究对象和目的，探针的类型也有了许多改进，主要有以下几种：1）染色体特异重复序列探针：rDNA、端粒、着丝粒以及类似于α卫星、卫星Ⅲ等重复序列上重复元件可达106拷贝数，其杂交靶位点大于1Mb，杂交信号易于检测，常用于检测非整倍体；2）基因组探针：高等动物基因组DNA除过很小一部分的编码序列外有一些高频率的重复序列，进化上的保守性使其具有物种特异性，作为探针，可分析多倍体的起源、进化、基因组成等；3）单拷贝序列探针：针对靶片段中的单拷贝序列而选择的此类探针，通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大的插入片段；4）染色体文库探针：此类探针由从基因组文库中的一条染色体或某一区域核酸片段组成，片段较小，因此被破坏的可能性小。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列的存在、位置和数量。
该技术通常使用荧光染料标记DNA或RNA的探针来识别特定的序列。
在荧光原位杂交中，常常使用单链DNA或RNA的Oligonucleotide探针。
探针的序列与待检测样品中的特定DNA或RNA序列互相互补，使得探针和样品DNA或RNA序列可以杂交在一起。
探针可以被标记成许多不同的荧光染料，如荧光素、罗丹明等，以使得检测到的探针可根据颜色进行区分。
荧光原位杂交过程包括以下步骤：1. 选择合适的探针。
选择的探针实际上就是一个人工合成的核酸分子，其长度在20-200bp不等，可以与靶序列DNA或RNA中的任意位置相互匹配，检测的种类也包括基因、病毒、染色体等。
2. 标记探针。
标记探针是指把荧光染料等标记物与探针进行化学共价修饰，使之形成标记的探针，标记的探针使用单染色荧光或双染色荧光。
3. 处理样品。
把检测样品进行前处理、处理固定等。
4. 杂交。
把标记的探针打入处理好的样品中，如细胞、组织、染色体等，探针就会与相应的靶分子发生杂交，然后把样品用适当的盐洗。
5. 检测结果。
通过荧光显微镜进行探针的显示，可以看到细胞核内亮相区域，确定靶序列的定位和相应的染色体编号，并可以通过比较实验组和对照组的信号强度，得到目标序列的数量和比例。
荧光原位杂交在基因检测、疾病诊断、癌症诊断和治疗中都有广泛应用。
在基因诊断中，荧光原位杂交可以检测微观缺失、染色体重排列和染色体数目异常等，具有高准确度、高敏感度、高特异性和可显性等特点。
在肿瘤诊断和治疗中，荧光原位杂交是一种高效而准确的技术，可以评估患者的病情、选择合适的治疗方案，预测预后。
因此，荧光原位杂交在生命科学研究和医学诊断中的应用前景非常广阔。
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常用探针类型 — 重复序列探针
重复序列探针的结合位点是基因组中多拷 贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端 粒探针）所在的染色体区域。 着丝粒常常是A-T丰富区，而端粒已知含有 TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制 备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被 普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚 端粒缺失和标记染色体。
杂交流程
a.两要素：
探针和靶序列 b.标记探针
直接标记和间接标记
c.变性 探针和靶序列成为单链 d.混合杂交 e.间接标记探针需连接 荧光基团的步骤
FISH
荧光标记的DNA探针 （200-500bp）
荧光原位杂交特点
与其它原位杂交技术相比，FISH的优点：
①经济安全，快速方便； ②敏感性高，特异性强，背景低； ③宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂 交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色； ④使用G带玻片可作出回顾性分析；
结合技术相关检测项目
染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、 BoBs） 产前单基因病诊断 SNP Array 检测 某些代谢病的产前诊断
项目意义
较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体 数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分 析工作压力，能够有针对性的对样本进行处理。
工作基础
探针 商品化探针 原位杂交仪 Luminex xMAP 液相芯片检测平台
工作基础
工作人员 1）项目负责人 刘红卫，男，妇产科实验室技术负责人，毕业 于四川大学生物工程系遗传学专业，临床遗传优 生专业副主任医师，丰富的技术操作和管理能力。 2）项目组成员 赵少志，男，检验师，四川大学华西医院医学 遗传学硕士，中国遗传医学中心、医学遗传学国 家培训中心学员。
几种技术平台比较
技术
产前 BoBs 核型分析 FISH
13, 18, 21 微缺失 三体
解释容易
成本
平台费用
++ ++ +
++ +
++ -
+ -
+ ++ +
QF-PCR
++
--
+
++
--
细胞遗传学技术的比较
FISH相关项目
羊水细胞荧光原位杂交分析（包括未培养 和培养） 血细胞荧光原位杂交分析 其他各类细胞荧光原位杂交分析 SRY等单基因分析 胚胎染色体病诊断（PGD）
WCP探针（SKY）
技术结合—产前BoBS
BACs是人类DNA的长片段克隆序列，典型的150170kbp，相对于短的DNA探针具有更好的信噪比、 不受DNA质量影响、更高的覆盖率。 将BAC DNA探针耦联至Luminex xMAP荧光编码 的微球上，将FISH技术与Luminex技术平台结合， BACs-on-Beads技术可以在同一个微孔内实现多个 FISH探针的检测，相对于同时进行成百上千次FISH 实验。 高通量、标本来源广、快速、结果明确；除了检测 13，18，21，X，Y染色体拷贝数目的变化外，还 可检测9种常见的微缺失综合征。
技术结合 — FQ-PCR
来自于分子生物学技术-定量荧光聚合酶链 反应 和FISH的结合； 对染色体13、18、21、X和Y采用荧光引物 对染色体特异性高度多态性DNA短重复序 列进行PCR扩增，快速诊断非整倍体；特 定的基因引物可以检测基因的缺失与扩增 检测“有”或“无”和数目异常；位置异 常无法判断，如平衡性染色体重排。
缺点：
不能达到100%杂交，特别是在应用较短的 cDNA探针时效率明显下降。
常用探针类型 — 基因特异探针
基因特异探针靶向每条染色体只有一个拷 贝的DNA序列。 主要用于间期或中期染色体中识别染色体 易位、倒位、重复和缺失、邻近基因综合 征、标记染色体和染色体扩增等，可检测 基因的扩增和重排。
21三体FISH
常用探针类型 — WCP探针
全基因组绘画（WCP）探针是一种复合DNA探针。 除着丝粒和端粒区外，全基因组绘画探针对全长 染色体有高度亲和力。这些探针最适用于识别中 期染色体的基因组不平衡，尤其是在许多癌症中 观察到的复杂染色体重排。 M-FISH用特殊选择的窄带滤色片连续捕获5种荧 光色素中的每一种荧光色素图像；SKY用于荧光 色素组合分析的成像设备不同：冷电荷耦合器 (CCD)照相机和Fourier变换光谱法相结合，同步 曝光成像。 这些技术目前在国内一些重点细胞遗传学实验室 中开展。
简
介
原位杂交技术（in situ hybridization，ISH） Gall和 Pardue 1969年建立。 用标记的DNA或RNA作为探针，对组织细胞内的核酸或有 丝分裂中期的染色体进行原位检测和观察。
最初的探针大多以同位素3H、32P等标记，但因同位素标 记探针对人体有放射损害、实验周期长、放射自显影的分 辨率有限、环境污染等缺点，给研究及实际应用带来了诸 多不便。
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization ，FISH） 利用荧光物质标记探针（直接或间接），再进行杂交，可 通过荧光显微镜对靶序列进行定性、定位和定量分析
FISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方 法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传 学和分子遗传学之间的一座桥梁。开创了一个新的学科— —分子细胞遗传学。
精品课件！
精品课件！
1.快速且准确进行检测
FISH对于样本要求比较低，对于羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周 偏大、细胞培养失败、核型结果难以判读等各种原因导致的核型分析 失败均可针对性的给予弥补，解决占染色体数目异常的80-90%问题。
2.弥补核型检测失败无报告的问题
3.FISH与羊水染色体核型分析构成较为完整的染色体异常 诊断平台，提高了产科胎儿产前诊断水平。 4.BoBs可检测9种常见的微缺失综合征，拓宽了检测范围。