荧光原位杂交技术及其应用
荧光原位杂交技术的临床应用_概述及说明
荧光原位杂交技术的临床应用概述及说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以通过使用荧光探针与待测DNA序列特异性结合，实现对目标DNA的检测和定位。
该技术的广泛应用使其成为基因诊断、细胞生物学以及遗传学研究的关键工具。
本文将对荧光原位杂交技术进行全面概述，并讨论其在临床诊断和生命科学研究中的重要应用。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行介绍和讨论：首先，我们将简要介绍荧光原位杂交技术的基本原理和相关概念；接着，我们将详细阐述该技术在临床诊断中的应用，包括癌症相关染色体异常的检测与定位、遗传疾病的分子诊断与遗传咨询以及微生物检测和感染性疾病的诊断；然后，我们将探讨该技术在生命科学研究领域中的重要应用，包括基因组和染色体结构分析、基因表达调控机制研究以及细胞核内事件及细胞过程动态观察与实时监测；最后，我们将对荧光原位杂交技术进行总结和评价，并展望其未来发展趋势。
1.3 目的本文的目的是全面概述荧光原位杂交技术的临床应用，并介绍该技术在生命科学研究中的重要性。
通过阐述其基本原理和应用案例，旨在增进读者对该技术的了解，并为相关领域的研究人员提供指导和启示。
同时，我们还将对该技术的优势和局限性进行评价，以便读者更好地理解并运用荧光原位杂交技术。
2. 荧光原位杂交技术概述2.1 原位杂交技术简介荧光原位杂交技术是一种用于分析染色体、基因组和RNA等核酸序列的强有力的方法。
它基于亲和性结合原理，利用荧光标记的探针与待测样品中的靶序列进行特异性杂交，通过可见光或荧光显微镜观察探针与样品是否杂交成功，从而实现对目标序列的定位和检测。
2.2 荧光原位杂交技术的基本原理荧光原位杂交技术主要包括以下几个步骤：首先，利用DNA合成或PCR扩增方法得到所需的荧光标记探针；然后，通过氨基化反应将这些探针连接到具有亲和性活性分子（如尾牙肌动蛋白）上，形成完整的荧光标记探针；接下来，在待测样品上进行脱氧核苷酸（dNTP）逆转录DNA合成反应，并在此过程中引入树酰胺（digoxigenin）－标记或生物素－标记dUTP等标记探针；然后，对样品进行固定处理，并与探针进行杂交，使探针与样品中的互补序列结合；最后，利用可见光或荧光显微镜观察并分析杂交信号，实现对目标序列的检测和定位。
荧光原位杂交技术及其应用
荧光原位杂交技术及其应用作者：钱文丹陈波利来源：《乡村科技》2018年第25期[摘要] 荧光原位杂交技术是通过核酸探针杂交施加非放射性荧光物质的技术，是分子细胞中较优异的一种遗传学工具，具有良好的应用前景。
基于此，本文介绍荧光原位杂交技术的原理、技术要点，并探究其发展及应用情况。
[关键词] 荧光原位杂交技术；多色荧光原位杂交；组织微阵排列技术[中图分类号] Q781 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2018）25-51-21 荧光原位杂交技术原理荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术。
其基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性—退火—复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析[1]。
与其他杂交技术进行综合比较发现，荧光原位杂交技术（FISH）具有一些优势：循环周期短，稳定性高，非常安全；分辨率高，为3～20 Mb；探针能较长时间保存；多色标记，简单直观；在荧光显微镜下在同一切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到其相对序列和位置，从而大大加速生物基因组和功能基因组定位的研究。
2 荧光原位杂交技术要点FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体，也可以是间期细胞。
生物素、地高辛、Dinitrophenyl（DNP）、Aminoacetyl Fluorine（AAF）等均可用于探针标记。
近年来，大片段的DNA探针（100～400 kb）已被研制出来，由于控针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。
荧光原位杂交可以通过CCD（电荷耦合器件）相机系统或激光共聚焦扫描成像系统将摄取的信号存储在计算机中，经过软件特殊处理后显示在屏幕上。
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。
1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。
20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。
随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。
相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。
这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。
FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。
FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。
（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。
其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。
荧光原位杂交技术在基因检测中的应用研究
荧光原位杂交技术在基因检测中的应用研究荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是一种可以直接观察和检测染色体、基因或基因组序列的分子生物学技术。
该技术利用特异性核酸探针与待检测序列互补配对，并用荧光染料标记探针使其能够在细胞核中发光。
荧光原位杂交技术在基因检测中具有重要的应用价值，可以用于检测染色体结构异常、染色体重排、基因拷贝数变异等遗传变异。
首先，荧光原位杂交技术可以用于检测染色体结构异常。
染色体结构异常是导致许多遗传疾病的原因之一，如唐氏综合征、父本重组不平衡等。
通过使用能够与染色体特定区域互补配对的探针，荧光原位杂交技术可以直接观察染色体的形态和结构，从而发现染色体结构异常。
例如，当染色体发生部分缺失、部分重复或倒位等结构异常时，荧光原位杂交技术可以显示出异常的染色体区域与正常染色体区域之间的变异。
其次，荧光原位杂交技术还可以用于检测染色体重排。
染色体重排是指染色体之间的结构改变，包括互换染色体的片段、删除或重复染色体的片段等。
荧光原位杂交技术可以使用特定的探针，将探针标记在不同染色体的特定区域，从而检测染色体重排事件。
例如，探针可以用来标记染色体上的特定基因或序列，当染色体发生重排事件时，探针可以显示出不同于正常情况的杂交信号，从而揭示重排事件的存在。
此外，荧光原位杂交技术还可以用于检测基因拷贝数变异。
基因拷贝数变异是指基因的拷贝数量在个体间存在差异，是一种常见的遗传变异形式。
荧光原位杂交技术可以使用基因特异性的核酸探针，将其标记在细胞核中的目标基因上，并通过观察荧光信号的强度来检测基因拷贝数的变异。
例如，如果一些基因存在拷贝数增加或减少的变异，荧光原位杂交技术可以显示出相应的增强或减弱的信号。
总而言之，荧光原位杂交技术在基因检测中具有广泛的应用，可以用于检测染色体结构异常、染色体重排、基因拷贝数变异等遗传变异。
这种技术的应用可以提供重要的遗传学信息，并对遗传病的诊断和预测起到重要的作用。
荧光原位杂交的原理及在产前诊断中的应用
荧光原位杂交的原理及在产前诊断中的应用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种基于核酸互补配对原理的分子生物学技术，通过标记的探针与待测样品中的特定序列发生互补配对，从而实现对特定基因或染色体的定位和检测。
这项技术具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的特点，因此在产前诊断中得到了广泛的应用。
荧光原位杂交的原理是利用互补配对原则，即DNA的碱基对A与T之间形成两个氢键，而G与C之间形成三个氢键。
荧光原位杂交实验中，首先需要制备特异性的探针。
探针一般是由DNA片段或人工合成的寡核苷酸链构成，其中的核酸序列与待测样品中的目标序列互补配对。
探针的核酸链上标记有荧光染料，通过荧光信号可以检测到探针的靶向结合。
在荧光原位杂交实验中，首先需要对待测样品进行固定处理，使DNA在细胞或组织中得以保持原有的空间结构。
然后，将标记有荧光染料的探针与待测样品进行孵育，在适当的温度下让它们发生互补配对反应。
随后，利用荧光显微镜观察标记的探针是否与待测样品中的目标序列结合，并通过图像分析系统对荧光信号进行定量和定位分析。
荧光原位杂交技术在产前诊断中发挥了重要的作用。
产前诊断是指在胚胎发育早期对胚胎进行检测，以确定胚胎是否存在异常基因或染色体异常。
常见的产前诊断方法包括羊水穿刺、脐带血采样等，但这些方法对胚胎有一定的损伤风险。
相比之下，荧光原位杂交技术具有无创伤、准确、快速等优势。
在产前诊断中，荧光原位杂交技术主要应用于染色体异常的检测。
例如，唐氏综合征是由于染色体21上三个同源染色体的非整倍体所导致的一种遗传病。
通过使用标记有荧光染料的探针与染色体21上的特定序列发生互补配对，可以在荧光显微镜下观察到染色体21的异常数量和结构，从而诊断是否存在唐氏综合征。
荧光原位杂交技术还可用于检测其他染色体异常，如父源性染色体易位、染色体缺失或重复等。
通过选择特定的探针，可以针对不同的染色体异常进行检测和分析。
荧光原位杂交临床应用
荧光原位杂交临床应用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种常用的细胞遗传学技术，主要用于检测染色体异常、基因缺失或扩增以及基因重排等。
随着技术的不断发展，荧光原位杂交已经广泛应用于临床诊断和研究领域。
荧光原位杂交技术利用荧光探针与待检测的DNA或RNA序列进行特异性结合，通过观察荧光信号的强度和位置来判断目标序列的存在与否。
相比传统的细胞遗传学方法，荧光原位杂交具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的优点，能够在细胞水平上直接观察到目标序列的存在情况。
在临床应用方面，荧光原位杂交已经成为一种重要的诊断工具。
例如，在肿瘤学领域，荧光原位杂交可以用来检测癌基因的扩增或融合，从而帮助医生确定肿瘤的类型和预后。
此外，荧光原位杂交还可用于检测染色体异常，如唐氏综合征和爱德华综合征等，为遗传病的早期筛查提供了一种快速、准确的方法。
除了临床诊断，荧光原位杂交还在研究领域发挥着重要作用。
通过荧光原位杂交技术，研究人员可以观察细胞内基因的表达情况以及染色体的结构和功能，进一步理解基因调控和细胞分裂等生命过程。
此外，荧光原位杂交还可以用于研究基因组的结构和演化，揭示不同物种之间的遗传关系。
近年来，随着新一代测序技术的发展，荧光原位杂交也得到了进一步的改进和应用。
例如，结合荧光原位杂交和单细胞测序技术，可以在单个细胞水平上分析基因组结构和表达差异，为个体化医学提供更精准的诊断和治疗策略。
尽管荧光原位杂交在临床应用中取得了一定的成功，但仍然存在一些局限性。
首先，荧光原位杂交只能检测已知的特定序列，对于未知序列的检测能力有限。
其次，荧光原位杂交的信号分辨率受到细胞核大小和染色质结构的影响，可能存在误差。
此外，荧光原位杂交的数据分析和解读也需要较高的专业技术。
荧光原位杂交作为一种重要的细胞遗传学技术，在临床诊断和研究领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和改进，相信荧光原位杂交将会在基因诊断和个性化医学中发挥越来越重要的作用，为人类健康事业做出更大的贡献。
荧光原位杂交技术及其应用
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本原理及该技 术在 生物学和 医学中的应用。
关键词 荧 光原位 杂交 应用
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荧光原位杂交检测原理和临床应用
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荧光原位杂交技术及其应用摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染色体数目异常和复杂染色体异常的诊断，架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。
本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。
关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤Fluorescence in situ hybridization and applicationsSUN Jingjing,YAN Shouqing(College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China)Abstract:FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics.Key words:FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; TumorDNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法[1]。
该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。
1 FISH技术的产生1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。
1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。
1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985年这项技术被引进到植物。
1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性，从而开辟了间期细胞遗传学研究[3]。
2 FISH的原理荧光原位杂交技术原理是将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合，通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。
与其他原位杂交技术相比，荧光原位杂交具有很多优点，主要体现在：①FISH不需要放射性同位素作探针标记，安全性高；②FISH的实验周期短，探针稳定性高；③FISH能通过多次免疫化学反应，使其杂交信号明显增强，从而提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；④FISH的分辨率高达3-20Mb；⑤FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针，再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子，因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序，从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究[4]。
3 FISH技术的发展在20世纪90年代，FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。
3.1 多色荧光原位杂交（M-FISH）多色原位杂交(M-FISH)，“M”分别代表“Multicolor”、“Multiplex”和“Multitar get”3种类型。
M-FISH的最大特点是：可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。
Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色FISH 技术。
1990年Nederlof等提出用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列，创建了多色FISH方法。
以下五种方法是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术：染色体描绘(chromosome paint ing)、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)、光谱染色体自动核型分析(spectral karyotyping, SKY)、交叉核素色带分析(cross-species color banding, Rx-FISH)、多彩色原位启动标记(multicolor primed in situ labeling, multicolor PRINS) [5]。
3.2 DNA纤维荧光原位杂交技术(DNA fiber-FISH)Wiegant等和Heng等首先利用化学方法染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA 作为载体进行FISH，使FISH的分辨率显著提高，就是最初的纤维-FISH。
Parra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)，Florijn等(1995)，进一步改进了伸展DNA纤维的方法，使DNA纤维的伸展程度从最初的80kb/μm达到了现在的2.5-3.5kb/μm，这一数值与Watson-Crick建立的DNA双螺旋模型中B-DNA分子的理论值2.97kb/μm十分接近，因此可以说现在得到的DNA纤维基本上是裸露的双螺旋DNA分子。
纤维-FISH的关键就在于何制备高质量的线性DNA纤维纤维-FISH具有高分辨率,能进行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子(<10个)，灵敏度高等优点由于纤维-FISH的这些优点使得它在染色体图谱绘制，基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用[1]。
3.3 组织微阵排列技术(tissue microarray)Microarray可以在1次实验中检测出数百个基因在1个细胞中的表达情况(包括降低和增高)。
Tissue array则在1次实验中能检测出1个基因在数百个细胞中的表达情况。
Tissue microarray是由Tissue microarray区域中500-1000单个肿瘤组织联合筒状活检构成的，将活检组织切成200多片用于DNA、RNA探针。
单个杂交提供单个载玻片上所有样本的信号，以后的切片可以用其他探针或抗体分析。
同一个组织样本切片的多重叠区域可以形成数千张切片[6]。
组织和cDNA微阵排列技术相结合提供一种有力的体内鉴定基因的方法，可以对癌或其他疾病的分子改变做出重要评估。
3.4 荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics, FICTION)FICTION是1种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法，这种方法可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变。
FICTION形态学有关，可以对档藏材料作回顾性研究[7]。
FICTION诊断快速，可以再现，适合FISH分析前或后没有所需以前细胞标本的细胞学样本[8]。
FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对肿瘤病理组织更好的了解。
4 FISH技术的应用FISH技术已经在细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用。
4.1染色体结构变异与非整倍体的检测荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。
如植物染色体的非整倍体是由于染色体行为异常，即可能是双亲配子染色体数目和结构差异引起或染色体亲缘关系较远等因素导致。
利用原位杂交可比较容易地检测出缺失、附加或替换的染色体[9]。
4.2 基因扩增和缺失的检测FISH空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基因在抗病虫害细胞中定位成为可能[10]。
被扩增基因主要在同一染色体臂上，但离初始亲本基因有一定距离，且经常独立地位于染色体端粒部位；FISH分析表明细胞断裂可能是由于染色体含有扩增区域的结构重排。
同时用FISH可定位转基因植物中外源基因位置和拷贝数，此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦等作物中已获成功。
利用FISH技术也可检测一些与遗传性疾病相关的基因缺失，如成功检测了aniridia疾病(一种虹膜缺失的罕见遗传异常疾病)患者的缺失基因。
4.3 基因定位荧光原位杂交的基因定位技术有着广泛的应用。
PP2Ac突变型肺癌相关基因在染色体区域的定位，荧光显微镜下观察记录和分析杂交信号的特征。
结果在正常人淋巴细胞的染色体5q23-31可见明显杂交信号，在GLC-82细胞的5号和7号染色体上出现较强信号。
说明点突变引起PP2Ac活性改变，从而基因易位，导致肺肿瘤的产生[11]。
FISH技术与生化、计算机和重组DNA技术结合检测Alu位点，表明DNA序列与带型有关。
用FISH技术对人类基因组中编码基因分布的研究揭示，基因主要集中在染色体上G+C(占全基因组35% )最丰富的DNA区段。
FISH技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。
应用FISH技术可直接观察染色体端粒，这简化了染色体在核内的结构和功能研究。
4.4 基因作图用FISH技术可直接检测DNA在染色体上的位置，所确定位置是基因在染色体上实际的物理位置。
由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响，FISH技术已成为重复序列和多基因家族作图的重要手段，如M.C lark等用荧光原位杂交方法在大麦第5号染色体制作出B-醇溶蛋白位点的物理图谱。