荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤

FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。试验方法如下：

1）玻片处理

（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温

过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。称

量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进

行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC

水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase

和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：

（a）缓冲溶液

1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，

溶入1000mL超纯水；

3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，

溶入1000mL超纯水；

通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获

得。

（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）

称取2gPFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3×PBS缓冲液，在冰浴中

充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。

向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。用0.45微米的膜过滤后使用。

（室温或4℃保存备用）。

注意：

1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），

因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺

激作用；

2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；

3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应

尽早使用。

4、PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保

持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在

2～3小时，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生

物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。

（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。

（d）DAPI溶液

用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL

H2O）。（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。

取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10～50 µM的DAPI溶液。

3）取样及保存方法

（a）反应器沉淀前取样2～5mL至离心管。

（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。

（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h。

（d）样品离心(12000r/min)5min，去上清夜。

（e）加入1×PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min，去上清夜（重复3次）。（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。

4）样品固定：

稀释样品3～5倍，对样品进行超声处理（3W超声2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数。然后取3μL样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h （或者在空气中干燥2h或者过夜）。依次用50%、80%、98%（质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。

5）样品杂交

试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB），其组分如表1-1和表1-2。

表1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）

5%10%20%30%35%40% 0.05%SDS（μL） 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

50mM Tri-HCl (μL）242424242424

5mol NaCl（mL） 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32

甲酰胺（mL） 1.2 2.4 4.87.28.49.6

蒸馏水（mL）18.454817.254814.854812.454811.254810.0548

NIT3探针Nsm156Ntcoc206Ntspn693Nsv443Ntspa662

NS01225Nmv

表1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）

组分体积

0.05%SDS（μL）0.6μL

50mM Tri-HCl （μL）12μL

5mol NaCl（mL） 2.16 mL

蒸馏水（mL）42.8274 mL

（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。

（b）吸取10μL探针贮存液和80μL杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL，用无菌水稀释购买的

探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。