荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤
羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤未培养羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤一、羊水标本玻片制备1.Hanks胰酶消化：5-8ml未培养羊水标本离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入5ml水浴加热至37℃的Hanks胰酶溶液（0.25%），充分混匀，37℃水浴25min；2.低渗：离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入8ml水浴加热至37℃的低渗液（0.075M KCL），充分混匀，37℃水浴30min；3.预固定：迅速加入1ml新鲜配制的固定剂（甲醇∶冰乙酸=3∶1），并立即轻柔混匀细胞悬液，2500转/分钟离心10min，弃上清；4.固定：加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，固定30分钟以上或放置过夜，2800转/分钟离心10min弃上清，加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，2800转/分钟离心10 min弃上清，根据细胞多少加入0.2-0.5ml新鲜配制的固定剂，调至适宜浓度后滴片；5.滴片：将2-3滴细胞悬液滴加在用冰水预冷的干净载玻片上，并立即将玻片放入75℃的烤箱中，待表面干燥后取出编号；6.烤片：将玻片放入60℃烤箱中烘烤2 hr；7.Rnase A处理：标本玻片杂交区用40μl 0.1mg/ml RNAase A 溶液（溶解于2×SSC）于37℃处理30-50min，再用2×SSC于室温洗2min，依次放入70%，90%，100%的酒精中脱水各2min，室温晾干玻片。
8.胃蛋白酶消化：将玻片放入水浴加热至37℃的胃蛋白酶溶液（0.25%）中处理5min,立即取出玻片，在室温条件下，依次将玻片放入2×SSC、70%、90%、100酒精中各处理2分钟，气干玻片。
二、探针、玻片变性及杂交9.探针变性：按试剂说明书配制探针液，于75℃水浴变性5min；10.玻片变性：玻片于75℃变性液（70%甲酰胺/2×SSC）中变性5min，酒精梯度脱水迅速风干玻片；11.将已变性探针5μl加在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周压紧，再用透明胶包扎密封玻片，放入湿盒中于37℃杂交过夜；二、杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号12.洗脱：小心揭去透明胶和蜡膜，玻片依次于洗脱液I(WS-I)中45℃洗3次×2min，洗脱液II(WS-II)中25℃洗3次×2min,洗脱液III(WS-III)中25℃洗1次×2min，酒精梯度脱水风干玻片；13.结果观察：加5μl DAPI（0.5mg/ml）复染，盖上盖玻片，20min后用荧光显微镜观察信号，照像并计数。
FISH操作步骤
FISH 荧光原位杂交基本的实验方法。
（mRNA 和基因组DNA）基因组DNA 荧光探针染色步骤1、细胞爬片/涂片/冰冻切片的复水0.1mol 枸橼酸缓冲液浸泡冰冻切片室温10 分钟使组织细胞恢复水性。
2、置打孔液中室温10 分钟，给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜。
0.1M PBS 冲洗三次。
3、50% 去离子甲酰胺60度 1 小时2XssC洗一次2N 盐酸30 分钟室温PBS 洗2 次后，95度水浴加热15 分钟（置0.1molPBS 中防止组织细胞干涸）后，迅速置于冰育防止DNA复性减低杂交信号。
0.1M PBS 冲洗三次。
4、滴加复合消化工作液，覆盖组织表面，室温10-30 分钟。
（根据实验组织和实验的条件情况确定消化时间和温度，需实验者摸索最佳条件。
如条件成熟有利于杂交的顺利完成，具体原理参照“组织细胞的通透性”和“复合消化液的配制”一章。
0.1M PBS 冲洗三次。
0.2Xssc 洗一次（室温3 分钟）。
5、滴加预杂交工作液覆盖组织42 度湿盒孵育4-8 小时,注意盖上原位杂交专用盖玻片（预杂交工作液反应时间，需实验者摸索最佳条件，如条件成熟有利于杂交后的背景降低。
如预杂交工作液反应时间过长反而影响杂交信号。
具体原理参照“预杂交原理”一章。
6、预杂交后的洗涤——揭去盖玻片以0.2Xssc 室温洗三次，每次洗涤5 分钟。
7、滴加杂交工作液覆盖组织42 度湿盒孵育8-12 小时。
注意：探针浓度和时间需实验者摸索最佳条件，具体原理参照“探针浓度和杂交时间”一章。
8、杂交后的洗涤——揭去盖玻片以2Xssc 37 度洗三次，每次洗涤5 分钟，0.2Xssc 37 度洗三次，每次洗涤5 分钟，0.1 mol TBS 37 度洗3-5 次每次洗涤5 分钟。
9、荧光显色- --甘油封片荧光显微镜下以激发光488-492nm 时观察到黄绿色荧光。
如荧光强度或背景太亮时，可以用0.1mol PBS 多洗若干次。
荧光原位杂交FISH操作规程
荧光原位杂交FISH操作规程
一、主要试剂
1变性液20SSC 4ml ddH 2O 8ml甲酰胺28ml
2PBD液 1000ml 20SSC中加入1.25gTween20
二、操作流程
1硅化玻片切片烤片60过夜
2脱蜡入水斜置切片空干
32SSC洗涤三次每次5min下简写为35
4 0.2M HCl处理室温10接步骤3
5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3
6切片入20梯度酒精脱水各2空干
7切片入85变性液8
8迅速入20梯度酒精脱水各2空干
9杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片
37过夜
10反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
112SSC洗涤405min2SSC洗涤375min
12PBD洗涤切片32
13滴加异硫氢酸荧光素标记的亲和素Avidin FITC,塑膜封
片3730min
14洗涤同步骤12
15滴加抗亲和素Anti Avidin, 3730min
16) 重复步骤121312
17滴加DAP/I(二脒基二苯基吲哚/碘化丙啶)直接封片荧光
镜检
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FISH技术全攻略
FISH技术全攻略FISH技术，即荧光原位杂交技术，是一种常用于细胞和组织中DNA 和RNA分子的定位和检测的方法。
它利用荧光标记的探针与待测物（DNA 或RNA）特异性结合，并通过显微镜观察荧光信号的强弱、位置等特征，从而实现对目标分子的检测和定位。
下面是FISH技术的全攻略。
一、实验准备1.准备标记探针所需的DNA或RNA杂交模板。
2.选择适合的荧光标记物，如荧光素或荧光染料。
根据待测物的特异性，选择合适的探针序列。
3.选择适当的杂交缓冲液和嵌合反应缓冲液。
4.准备样本制备所需的试剂和器材，如细胞培养液、组织切片等。
二、标记探针1.获得待测物的DNA或RNA序列，并设计与之特异性结合的引物。
2.利用引物将待测物扩增，并进行纯化。
3.利用PCR或反转录-PCR等方法将引物和合适的荧光标记物连接起来，形成标记探针。
4.对标记探针进行纯化和定量，确保其纯度和浓度适当。
三、样本制备1. 细胞样本制备：将待检测的细胞培养在无菌条件下，收集并进行固定处理，如用甲醛溶液固定细胞，并进行膜通透处理，如用0.1% Triton X-100等溶液处理。
2.组织样本制备：将待检测的组织收集起来，并进行固定处理和脱水处理，如用乙醚和乙醇等溶液处理。
四、杂交反应1.准备杂交缓冲液：根据具体要求配制适当的杂交缓冲液，如SSC缓冲液（含盐和柠檬酸），并加入适量含有探针的杂交模板。
2.加热探针和杂交目标：将探针和待测物的杂交模板一起加热处理，使其变性。
3.杂交：将变性后的标记探针与杂交模板进行杂交，使其重新结合。
4.温度控制：根据具体情况选择合适的杂交温度和时间，并进行合适的温度控制。
五、信号检测与图像分析1.温度冲洗：在特定的温度和缓冲液条件下进行冲洗，去除未结合的探针和杂交模板。
2.荧光显微镜观察：将样本放在显微镜下，观察和记录荧光信号的强度和位置。
3.图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜下观察到的图像进行处理和分析，如测量信号的强度和位置。
荧光原位杂交(FISH)操作方法
荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
荧光原位杂交
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。
下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。
非生物学专业的同学请不要往下看了。
1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。
3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
荧光原位杂交 FISH 操作方法
荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
fish原位杂交操作流程
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荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：
1）玻片处理
（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温
过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称
量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进
行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC
水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase
和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：
（a）缓冲溶液
1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，
溶入1000mL超纯水；
3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，
溶入1000mL超纯水；
通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获
得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
称取2gPFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
然后向其中加入16.5ml 3×PBS缓冲液，在冰浴中
充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。
向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。
用0.45微米的膜过滤后使用。
（室温或4℃保存备用）。
注意：
1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），
因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺
激作用；
2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；
3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应
尽早使用。
4、PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保
持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。
样品固定时间在
2～3小时，RNA含量较为恒定。
过度延长固定时间会引起细胞内生
物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。
（d）DAPI溶液
用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL
H2O）。
（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。
取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10～50 µM的DAPI溶液。
3）取样及保存方法
（a）反应器沉淀前取样2～5mL至离心管。
（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。
（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h。
（d）样品离心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1×PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min，去上清夜（重复3次）。
（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。
4）样品固定：
稀释样品3～5倍，对样品进行超声处理（3W超声2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数。
然后取3μL样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h （或者在空气中干燥2h或者过夜）。
依次用50%、80%、98%（质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。
5）样品杂交
试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB），其组分如表1-1和表1-2。
表1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）
5%10%20%30%35%40% 0.05%SDS（μL） 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
50mM Tri-HCl (μL）242424242424
5mol NaCl（mL） 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32
甲酰胺（mL） 1.2 2.4 4.87.28.49.6
蒸馏水（mL）18.454817.254814.854812.454811.254810.0548
NIT3探针Nsm156Ntcoc206Ntspn693Nsv443Ntspa662
NS01225Nmv
表1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）
组分体积
0.05%SDS（μL）0.6μL
50mM Tri-HCl （μL）12μL
5mol NaCl（mL） 2.16 mL
蒸馏水（mL）42.8274 mL
（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。
（b）吸取10μL探针贮存液和80μL杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL，用无菌水稀释购买的
探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。
表1-3用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件
探针序列(5’~3’)标记细菌种属浓度a
35 NSO1225CGCCATTGTATTACGTGTGA Ammonia oxidizing
beta-proteobacteria
30
Nsv443CCGTGACCGTTTCGTTCCG Nitroso-spira，-lobus，
-vibrio
Nmv TCCTCAGAGACTACGCGG Nitroso-coccus35 Ntspa662GGAATTCCGCGCTCCTCT Nitrospira35
NIT3CCTGGCTCCATGCTCCG Nirtrobacter40 Ntcoc206CGGTGCGAGCTTGCAAGC Nitrococcus mobilis10 Ntspn693TTCCCAATATCAACGCATT Nitrospina gracilis20
注：
（a）表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（b）吸取9μL预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2～3h；（c）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。
杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
DAPI染色
每孔滴9uLDAPI，4℃暗处5min，4℃冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。
用带有360 nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
DAPI （4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。
封片
涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集20个不同区域。
每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。
细菌丰度或细菌数目（cells/g或cells/L）为AS1/(S2V)，其中A为视野中细菌平均数；S1为样品涂抹面积；S2为视野涂抹面积；V为样品体积。