EBER原位杂交过程
EBER显色原位杂交技术在口腔颌面部淋巴上皮癌中的应用体会
EBER显色原位杂交技术在口腔颌面部淋巴上皮癌中的应用体会目的探讨EBER显色原位杂交技术（CISH）在口腔颌面部淋巴上皮癌中特有的操作与改进方法。
方法应用CISH技术，荧光素标记的寡核苷酸探针EBER原位杂交检测试剂盒对40例疑为口腔颌面部淋巴上皮癌的病例进行EBER检测。
结果EBER阳性率为95%；阳性信号主要定位在肿瘤上皮细胞巢的细胞核上，呈棕黄色，周围淋巴细胞及正常组织未见明显着色；信号定位准确，染色结果清晰易辨，无背景干扰。
结论简化操作EBER原位杂交检测试剂盒能够节省时间、增强信号强度和提高工作效率等。
标签：EBER；显色原位杂交技术；淋巴上皮癌；EB病毒EBER（Epstein-Barr virus-encoded RNA）为EB病毒的表达产物，是EB病毒编码的mRNA，在细胞核中以高拷贝数存在[1]。
人感染EB病毒与鼻咽癌的发生有密切关系[2-4]，在全身其他肿瘤性疾病（传染性单核细胞增多症、多发性硬化症、伯基特淋巴瘤等）中也有一定比例的EB病毒感染[5]。
部分发生于口腔颌面部的肿瘤如淋巴上皮癌、结外NK/T细胞淋巴瘤中[6-7]，EBER的表达情况可以作为辅助诊断的手段，为肿瘤诊断提供必要依据。
EBER显色原位杂交技术（chromogenic in situ hybridization，CISH）是检测EBER是否表达的技术之一，其原理是利用EBER特异性探针与标本中EBER靶序列互补、杂交后，通过DAB 显色技术，确定标本中是否存在EB病毒感染，该方法具有极高特异性和灵敏性，可用于石蜡和冷冻切片的检测。
目前，CISH已应用于鼻咽癌等肿瘤的辅助诊断，近两年来，本科室对疑为淋巴上皮癌的病例进行EB病毒感染的检测，现把操作体会总结如下。
1.1 材料与方法1.1 标本收集收集2012年9月～2013年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科疑为淋巴上皮癌的石蜡标本共40例，其中男性21例，女性19例，年龄23～85岁，中位年龄51.5岁。
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤原位杂交实验呀，就像是一场精心编排的舞蹈。
首先呢，得准备好舞台，也就是标本的处理。
这就好比给舞者们准备一个合适的场地，要把标本固定好，让它稳稳地待在那儿，可不能在中途出啥岔子。
接下来，就是探针的准备啦。
这探针就像是舞蹈的主角，得精心挑选和设计。
它要能准确地找到自己的目标，和标本上特定的序列结合。
然后，杂交这一步可太关键啦！就像舞者们在舞台上的精彩互动。
让探针和标本在合适的条件下相遇、结合，产生奇妙的反应。
之后呢，要进行信号的检测。
这就好比要看到舞者们的精彩表现呈现出来的效果。
通过各种方法，让杂交后的信号能够清晰地被我们看到。
再说说洗片这一步吧，就像是给舞台打扫干净。
把多余的杂质、干扰都去掉，只留下最精彩的部分。
整个过程中，每一步都得小心翼翼，就跟跳舞时每个动作都要精准到位一样。
要是哪一步出了差错，那可就像舞蹈中出现了失误，会影响整个演出的效果呀！做原位杂交实验，还得有耐心。
不能着急忙慌的，得一步一步慢慢来。
就像跳舞，不能一下子就跳到结尾，得按照节奏，一个动作一个动作地来。
而且呀，实验环境也很重要呢。
温度啦、湿度啦，都得控制好，这就好比舞蹈的灯光、音响，得配合得恰到好处，才能让整个表演更加完美。
想象一下，如果标本处理得不好，那后面的步骤不就都白费啦？或者探针没准备好，那还怎么去找到目标呢？所以啊，每一步都不能马虎，都得认真对待。
这原位杂交实验，可不就是一场科学与技术的精彩舞蹈嘛！咱可得把这场舞跳好，跳出精彩，跳出成果来！这就是原位杂交实验的步骤啦，大家可都得记住咯！。
2020版：肠道EB病毒感染组织检测和病理诊断共识(全文)
2020版：肠道EB病毒感染组织检测和病理诊断共识（全文）中国人群EB病毒(Epstein-Barr virus)血清学阳性率高达95%以上[1,2,3]，绝大部分属于潜伏感染。
当全身或局部免疫力低下时，可引起EB 病毒的再激活，导致EB病毒机会性感染。
IBD患者肠道局部炎症刺激和免疫抑制剂的使用，易导致EB病毒重激活并加重病情[4,5]。
肠道EB病毒感染的诊断及其对IBD病情发展的影响日益受到关注。
结肠黏膜活组织检查(以下简称活检)标本中EB病毒感染检测是确定肠道EB病毒感染的主要方法。
为统一肠道EB病毒感染的组织标本检测及判读方法，并进一步规范肠道EB病毒感染的临床病理诊断，中华医学会消化病学分会消化病理协作组组织专家进行了肠道病理组织EB病毒感染检测质量控制和EB病毒感染意义共识讨论会，对EB病毒感染的检测方法、判读、计数和临床病理意义等开展广泛讨论并达成共识。
一、肠道黏膜活检取材肠道EB病毒感染时，病毒在黏膜组织中分布不均，溃疡处病毒负荷显著高于非溃疡黏膜[5,6]，为确定有无EB病毒感染，内镜活检取材部位应重点位于溃疡处。
但是初诊患者或诊断不明的患者，为明确诊断，内镜活检应为系统性活检，上消化道活检部位应包括食管、胃体、胃窦和十二指肠，下消化道活检部位应包括回肠末端、盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠，取材应取溃疡旁黏膜组织，避免只在溃疡底部取材。
二、EB病毒感染检测方法EB病毒感染检测方法包括原位杂交、PCR和免疫组织化学技术。
原位杂交检测EB病毒编码的小RNA(Epstein-Barr virus-encoded RNA, EBER)在EB病毒潜伏期和病毒复制期均大量存在于感染细胞的细胞核内，EBER原位杂交可在组织切片确定EB病毒感染细胞及其在组织中的定位[7,8,9]。
PCR可定量检测EB病毒DNA，但无法确定感染细胞及其在组织中的定位，常用于检测外周血EB病毒负荷[10]。
EBER及HPV原位杂交试剂盒及相关产品知识
EBER原位杂交原理
EBER：EBV编码的小RNA，胞核内 EBER表达量很高，各期均可表达，
最适用于临床诊断EBV感染 原理：单链DNA探针与小RNA杂交 定位：细胞核
EBER的临床应用价值（一）
协助临床诊断：
诊断EBV感染性疾病，如：传染性单核细胞 增多症、慢性活动性EBV感染
CCT、TCT都是PAP方法的改进
HPV-DNA病毒学检测
TCT+HPV检测（HC）
阴道镜下活检
即病理切片检查，严格说，已不属筛查范围
杂交捕获 vs 原位杂交
杂交捕获(HC)：定性，分型，临床，筛查 原位杂交(ISH)：定性，定位，分型，病理，
诊断 HC与ISH在应用上互补
HPV原位杂交产品的临床应用价值
使 用 指 导（三）
CIS、宫颈癌 首选：16/18型原位杂交或PCR分型 参考：通用型原位杂交（HPV阳性，辅助诊断） 原因：采用PCR分型，防止因原位杂交灵敏度不够而 可能导致的漏诊
泰普HPV原位杂交 vs PCR
宫颈癌组织： 原位杂交：20例（＋） PCR：20例（＋）（临床禁） 免疫组化：15例（－）
的交界处。
宫颈癌演变过程
尖锐湿疣，CIN I CIN II CIN III （重度非典型增生+CIS） 早期浸润癌
浸润癌 概念：
CIN：宫颈上皮内瘤，包括非典型增生和原位癌；病变 局限于上皮细胞层内，未突破全层
CIN I： 轻度非典型增生（病变不到上皮1/3） CIN II： 中度非典型增生（病变达到1/3，不到2/3） CIN III：重度非典型增生（病变达到2/3，但未及全层 ）
谢 谢 ！
无显著差异 鼻型NK/T细胞淋巴瘤：预后很差
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤(一)原位杂交1、溶液配置：（1）Hybridization buffer（20ml）：Formamide 10ml；20x SSC 5ml；Denhand’s2ml；100mg/ml yeast tRNA 50μL；10mg/ml salmon sperm DNA 1ml；Blocking regent 0.4g；DEPC-water 1.95ml。
（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。
（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。
（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。
（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。
（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。
（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。
（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；N BT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。
2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。
（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。
（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
EBER检测试剂盒(原位杂交)
E B E R 检测试剂盒（原位杂交）（操作之前请详细阅读此说明书）检测原理和意义EBER 是EB 病毒编码的小RNA ，是EB 病毒的表达产物，在EB 病毒感染的细胞核中以高拷贝数存在。
根据EBER 的特有序列设计的EBER 单链 DNA 探针能特异地与EBER 靶序列互补、杂交，从而检测EB 病毒是否存在。
此方法检测石蜡组织切片中的EB 病毒具有极高的特异性和灵敏性。
目前EBER 原位杂交已成为组织和细胞中EB 病毒的标准检测方法，在国际上广为使用。
试剂盒提供的材料和试剂（注意：EBER 杂交液请 -20℃保存）成 份保存方法 提 供 量20人份 50人份 1 EBER 杂交液 -20℃ 400ul 1.0ml 2 蛋白酶K 4℃ 40ul 100ul 3 一抗 4℃ 1ml 2.5ml 4 二抗 4℃ 1ml 2.5ml 5 HRP 聚合物 4℃ 1ml 2.5ml 6 DAB 底物 4℃ 1ml 2.5ml 7 DAB4℃ 20ul 50ul 8 18X18mm 盖玻片 4℃/室温 20片 50片 9湿盒增效液4℃/室温30ml30ml用户自备材料和试剂1. 55℃恒温培养箱8.二甲苯2. 37℃恒温培养箱9.酒精3. 光学显微镜10. PBS(pH=7.6)4. 移液器11. 苏木素5. 计时器12. 氨水6. 玻片染色缸和染色架13. 盐酸酒精7. 湿盒2个实验前需配试剂30％湿盒增效液取湿盒增效液及蒸馏水，按3:7配制成30%湿盒增效液备用。
实验时需配试剂A、1X蛋白酶K将蛋白酶K与1×PBS按1：25的比例配制备用。
（现配现用）B、DAB显色液依据需要配制DAB显色液，以可覆盖整个组织的量为宜。
取DAB与DAB底物，按照1：50的比例混匀，避光保存备用。
(现配现用)操作步骤1．切片处理：将4um厚度的组织粘附在APES处理的载玻片上，切片于60-70℃烘烤60分钟以上。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟;2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟;3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟;4） PBS清洗3分钟；5) 2％焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;6） PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟;9） 0。
2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟;11）0。
25％无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片;17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1—1ng/mlPBS中)，37℃孵育30分钟;19）PBS清洗5分钟；20）室温,2×SSC清洗10分钟；21）37℃,1×SSC清洗10分钟；22)37℃，0。
5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟;24）缓冲液A（1％正常绵羊血清和0。
03％三重氢核X-100）孵育30分钟;25)加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次,每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;28)制成NBT/BCIP暗处保存30—60分钟,显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时; 29）停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3) 95％乙醇浸泡2次，每次5分钟；4) PBS清洗5分钟；5） 2％焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6) PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟；8） PBS清洗2次,每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25％无水乙酸和0。
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预先准备的试剂
胃酶浓缩液：将胃酶中加入 4 毫升的蒸馏水或去离子水，充分溶解后可根据使用量分装，冻存（-20 °C）。
胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的1NHCl 用蒸馏水或去离子水10 倍稀释，即成0.1NHCl 溶液
PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解后加入Tween205 滴，混匀后使用。
DAB工作液配制：在1毫升5A中加入50微升的5B，临用前配制，未用完的液体应弃去。
也可按照上述比例，根据实际需要量配制。
胃酶消化工作液的配制
每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作液应弃去。
石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCI溶液100倍稀
释，例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的0.1NHCI溶液中，混匀后备用。
所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行，避免试剂蒸发。
一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。
样品的收集和预处理
石蜡切片：
常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12 小时。
石蜡包埋的温度不宜超过
65C。
4-6微米的石蜡切片，56-60C烤片2-16小时。
处理好的切片可以立即使用，也可放置于室温条件下保存（至少可保存3个月以上）。
在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡（10分钟X 2）。
脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后，经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。
酶处理（避免RNA 酶污染，带手套操作）
将切片放置于37C中，每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。
石蜡切片孵育30分钟。
弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水（70%、95%和100%），每个梯度放置 1 分钟。
空气干燥后杂交。
杂交程序（避免RNA 酶污染，带手套操作）
杂交：
混匀探针溶液，在每张切片上加10-20微升适量的探针（试剂3），加盖盖玻片（注意防止气泡！）。
湿盒中37C孵育2小时，杂交过夜效果更好。
冲洗：
将切片浸入PBS缓冲液中10分钟，直到盖玻片自然脱落，用PBS缓冲液冲洗切片2分钟X3次，取出切片，擦干多余的缓冲液。
检测和显色程序
切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（试剂4）, 37C孵育30
分钟，PBS冲洗1分钟X 3次（期间可摇动容器数次），用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟X 1次。
擦净切片边缘的水分，加入适量配制好的DAB 工作液。
显色5-15分钟，注意光镜下观察显色情况。
用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟X3次后，即可进行封片或复染。
复染程序
可苏木素复染，染色约5-10秒。
用蒸馏水或去离子水短时间冲洗，常规脱水、透明，封片。
无阳性表达可能原因：
1 .塑料制品：尽可能使用无菌、一次性塑料制品。
已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，有些厂家提供的产品已达到RNase-free，可以直接使用，再次处理容易造成二次污染，得不偿失。
但原则上国产塑料制品处理后方可使用。
处理方法如下：
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC有致癌之嫌，须在通风柜中小心操作。
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(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
(3)在通风柜中37 C或室温下处理过夜。
(4)将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
(5)用合适的温度(80-90 C)烘烤至干燥，置于干净处备用。
2. 玻璃和金属制品：实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有RNA酶污染，使用前必须于180 C干烤8小时或250 C烘烤3小时以上。
另一种方法是用0.1%的DEPC 水溶液浸泡。
3. 电泳槽：用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干
燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1轕C处理过的水彻底冲洗电泳槽。
最好能留出一些玻璃器皿，塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
4. 移液器：RNase的又一污染源是移液器。
根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。
移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源，实验前最好取下它。
5. 溶液：用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药
匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。
可能的话溶液应用0.1轕C水于37C至少处理12小时，然后于100 C加热15分钟或在15lbf/in2(1.034 105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。
注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液，可存几瓶新的，未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
6. 研究人员：RNA酶广泛存在于人的皮肤上，最主要的潜在污染源是研究人员的手。
因此，在准备分离和分析RNA的材料和溶液时，以及在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。
一、？防止RNA酶污染的措施??
1. ?所有的玻璃器皿均应在使用前于180C的高温下干烤6hr或更长时间。
？？
2. ?塑料器皿可用0.1%?DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能
使用)。
？？
3. ?有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡
在3%?H2O2?室温
10min，然后用0.1%?DEPC水冲洗，晾干。
？？
4. ?配制的溶液应尽可能的用0.1%?DEPC,在37C处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的
DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22卩m滤膜过滤除菌。
？？
5. ?操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
??
6. ?设置RNA 操作专用实验室，所有器械等应为专用。