原位杂交原理及具体操作
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交的原理
原位杂交的原理
原位杂交是一种核酸杂交技术，通过将标记有荧光物质的探针与待测样品中的靶标序列进行杂交反应来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的原理基于两种核酸之间的互补配对原则。
DNA或RNA的互补链能够在一定条件下进行杂交，即互相结合形成
双链。
探针是一段由核酸组成的序列，它与待测样品中的目标序列具有互补的碱基序列。
在原位杂交实验中，首先需要制备探针。
探针可以是由DNA
或RNA构成的，其中至少一部分标记有荧光物质。
荧光物质
的标记使得通过显微镜或其他荧光成像设备能够检测到杂交的信号。
探针与待测样品中的目标序列发生互补配对后，形成探针与目标序列的杂交复合物，即探针与靶标序列互相结合。
为了确保探针与目标序列的特异性结合，一般会在杂交反应中使用一些特异性的条件，如控制杂交温度、盐浓度和pH值等。
此外，还可以使用一些核酸结合蛋白的抑制剂来降低非特异性结合。
通过显微镜观察荧光信号的出现位置和强度，可以确定目标序列在细胞或组织中的位置和数量。
常用的观察方式包括荧光显微镜、原位杂交图像分析系统等。
总的来说，原位杂交利用探针与目标序列的互补配对原理，通
过荧光信号的观察来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
这种方法在生物医学研究和分子诊断中具有广泛的应用价值。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
简述原位杂交的原理及应用
简述原位杂交的原理及应用1. 原位杂交的原理原位杂交是一种基因组杂交技术，它可以用来研究基因组的组成、结构和功能。
原位杂交的原理是通过将一组标记有探针的DNA片段与目标DNA样品进行杂交反应，然后使用适当的探针检测方法来识别和定位目标DNA序列。
原位杂交的基本原理包括以下几个步骤：1.DNA探针制备：3’-OH末端标记方法和末端标记方法是两种常用的DNA探针标记方法。
常用的标记有生物素、荧光物质等。
2.DNA杂交反应：将标记好的DNA探针与目标DNA样品进行杂交反应。
杂交反应的温度、时间以及混合物的浓度需要根据具体实验目的进行优化。
3.杂交后的探针检测：可以使用放射性同位素标记、荧光染料标记等方法对杂交后的DNA探针进行检测，以确定杂交反应是否成功。
4.观察和分析：通过显微镜等工具观察杂交结果，并对杂交位点进行定位和分析，获取目标DNA序列的位置和数量。
2. 原位杂交的应用2.1. 基因组结构研究原位杂交技术可以用来研究基因组的结构，包括基因的数量、排列、序列和重组等信息。
通过特定的探针标记和杂交反应，可以对基因组进行定位和分析，帮助了解基因组的组成和结构。
2.2. 染色体显带分析原位杂交被广泛应用于染色体显带分析领域。
通过核酸探针的杂交，可以识别和鉴定染色体上的特定DNA序列，从而确定染色体的结构和功能。
这对于检测染色体异常和疾病的相关基因有着重要意义。
2.3. 基因定位和图谱构建原位杂交可用于基因定位和构建基因图谱。
通过使用特定的探针标记和杂交方法，可以将目标基因定位到染色体上的特定区域，并确定其在染色体上的位置。
这为进一步研究基因的功能和相互作用提供了基础。
2.4. 个体识别和物种鉴定原位杂交技术可用于个体识别和物种鉴定。
通过探针的杂交反应，可以确定个体或物种特定基因的存在与否，从而进行个体识别和物种鉴定的工作。
2.5. 植物杂交育种原位杂交可以应用于植物杂交育种领域。
通过对目标植物基因组的杂交分析，可以鉴定合适的亲本植物并进行精确的杂交操作。
原位杂交的原理及应用
原位杂交的原理及应用
原位杂交是分子生物学领域中的一种技术，主要用于检测和定位特定DNA或RNA序列的存在和位置。
这种技术通常使用放射性或非放射性标记的探针来与特定的DNA或RNA序列进行杂交。
原理：原位杂交的基本原理是利用互补配对的原则，将标记探针与被检测的DNA 或RNA样本的靶分子进行杂交反应。
这种技术通常利用一些特定的标记，如放射性同位素或非放射性荧光染料，来标记探针，使其可以在杂交后被检测到。
应用：原位杂交广泛应用于分子生物学和医学领域。
以下是一些具体的应用：
1、检测基因突变。
原位杂交可以检测基因突变或缺失，从而确定某些病理状态的原因。
比如，原位杂交技术可以用于检测肿瘤细胞中激活的癌基因或缺失的肿瘤抑制基因，帮助医生诊断和治疗肿瘤。
2、检测病毒感染。
原位杂交技术可用于检测病毒感染。
例如，在临床诊断中，原位杂交技术可以用于检测人乳头瘤病毒（HPV）感染，从而帮助预防宫颈癌的发生。
3、研究分子发育和进化。
原位杂交也可用于研究分子进化和发育。
例如，在分子系统学领域，原位杂交技术可以用来确定不同物种之间的亲缘关系，并研究其进化历史。
4、研究基因表达模式。
原位杂交还可用于研究基因表达模式，了解基因在生物体中如何发挥作用。
例如，在神经科学领域，原位杂交技术可用于研究神经元中活性基因的表达模式。
总之，原位杂交技术是一种重要的检测和研究分子生物学的方法，具有广泛的应用前景。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于检测和定位特定的DNA或RNA序列在细胞或组织中的存在和表达。
它通过将标记有特定标记物的探针与待检测的样品进行杂交反应，然后利用显微镜观察探针的位置和数量来确定目标序列的存在和表达水平。
原位杂交技术主要利用探针与目标序列间的互补配对来实现检测和定位，具有高灵敏度、高特异性和显微分辨率较高的优点，因此在生命科学研究和临床诊断中得到了广泛应用。
1.制备探针：探针是一段具有目标序列的DNA或RNA，通常通过聚合酶链式反应（PCR）或转录反应合成。
探针可以标记上荧光染料、放射性同位素或酶等标记物，用于在杂交反应后的检测。
2.样品制备：待检测的细胞或组织样品需要进行预处理，包括固定、脱水、解冻等步骤。
固定样品有利于保持细胞和组织的形态结构，使得探针能够与目标序列发生杂交。
3.杂交反应：将探针与样品进行杂交反应。
反应条件和时间需要根据探针的特性和样品的要求进行优化，包括温度、盐浓度等因素。
4.洗涤：在反应后，需要对样品进行洗涤来去除未杂交的或杂交不牢固的探针，以减少背景信号。
洗涤的条件需要严格控制，以保证背景信号的最小化。
5.检测和观察：使用适当的检测方法，如荧光显微镜、原子力显微镜等，来观察和记录探针的位置和数量。
原位杂交技术的应用广泛，主要包括以下几个方面：1.基因表达：原位杂交可以定位和观察特定基因的表达模式和水平。
通过检测RNA在组织或细胞中的存在和定位，可以研究基因的表达调控机制，揭示转录因子机制、信号通路等重要过程。
2.染色体定位：原位杂交可以在染色体水平上定位特定序列。
通过探针与染色体特定区域的杂交，可以确定染色体的结构和功能，并研究染色体异常与疾病的关系。
3.突变检测：原位杂交可以检测和定位基因突变或基因缺失。
通过使用特异性探针，可以检测DNA序列的缺失、插入或突变，从而提供有关遗传疾病的诊断和研究。
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原位杂交原理及具体操作原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。
而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。
（一）探针的选择根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。
在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。
但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。
例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA 获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。
长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。
在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。
在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。
如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。
但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。
如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。
对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。
这种方法十分简便，无论基因组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。
（二）探针的标记方法在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。
探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。
但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。
一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。
放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。
在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。
在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。
（三）探针的浓度总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。
另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。
依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。
探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。
（四）杂交率在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。
（五）杂交最适温度杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。
若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。
若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。
如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。
通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。
温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。
最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃苛刻复性温度：Ts = Tm –（10或15℃）非苛刻复性温度：Tns =Tm –（30或35℃）（六）杂交的严格性影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。
一般认为在低于杂交体?（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。
时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。
一般杂交反应要进行20h左右。
1966年Britten和Kohne 推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。
Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。
实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。
Cot=0，基本上没有杂交。
例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。
对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。
由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。
对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。
而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。
这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。
另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。
在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。
因此，使用促进剂时有必要优化条件。
另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。
与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。
酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。
而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。
此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。
总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。
时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。
一般杂交反应要进行20h左右。
1966年Britten和Kohne 推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。
Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。
实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。
Cot=0，基本上没有杂交。
例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA 每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。
对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot 值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。
由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。
对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。
而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。
这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。
另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。
在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG 则可产生很高的本底。
因此，使用促进剂时有必要优化条件。
另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。
与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。
酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。
而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。
此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。
总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。