原位杂交技术原理及其应用.60页PPT
原位杂交技术原理及其应用
原位杂交技术原理及其应用原位杂交是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置和表达情况。
它的原理是利用一段带有特定标记的DNA或RNA探针与靶标序列结合形成稳定的双链结构，从而可以通过可视化或其他手段来观察探针与靶标的结合情况。
1.样品的制备：收集细胞或组织样品，并进行适当的处理，例如固定、裂解或切片等。
2.探针标记：选择适当的DNA或RNA序列作为探针，并将其标记为可检测的分子，例如荧光染料、放射性同位素或酶等。
3.杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA靶标进行杂交，通过提供适当的温度和盐浓度等条件来促进结合。
4.洗脱：去除未结合的探针，并进行适当的洗脱步骤，以减少非特异性结合。
5.可视化：通过荧光显微镜、放射自显影或酶促成色等方法来观察探针与靶标的结合情况。
1.基因表达和定位：原位杂交可以用来检测特定基因在细胞或组织中的表达情况和位置。
通过使用标记的探针，可以确定基因在染色体上的位置，并了解其表达的细胞类型和数量。
2.染色体异常和重排：原位杂交可以用来研究染色体异常和重排，例如倒位、易位和染色单体等。
通过使用标记的探针，可以检测染色体上的特定序列，并观察异常的染色带和断裂点。
3.病毒和微生物检测：原位杂交可以用于检测病毒和微生物的存在和定位。
通过使用与病毒或微生物特定序列匹配的探针，可以确定它们在感染组织中的位置或数量。
4.基因组分析：原位杂交可以用于研究基因组的结构和功能。
通过探针的杂交，可以确定特定基因在基因组序列中的位置和分布情况，从而揭示基因重复和重组等生物学过程。
总的来说，原位杂交技术是一种强大的分子生物学工具，可以在细胞和组织水平上研究DNA和RNA的分子特性。
它在基因表达、染色体结构、病毒感染和基因组分析等方面具有广泛的应用潜力，对于理解生命过程和疾病机制有重要的意义。
原位杂交技术
荧光原位杂交：首先对寡核苷酸做特殊的 修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色 体或DNA 上特定的序列结合，通过与荧光 素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序 列在染色体的位置。
常用于已知基因或序列的染色体定位和未 克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。
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发展简史
1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的， 他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交， 确认该基因位于卵母细胞的核仁中。
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
超薄切片：
将镍网的切片面朝下浮于杂交液液滴上，置于湿 盒内杂交
（五）杂交后漂洗
用浓度递减的SSC溶液，在一定温度和震荡 下漂洗切片。（这一步骤可以调节严格度）
如果杂交信号太弱或没有，可以降低漂洗的严格度
如果背景太强、信号不特异，可提高漂洗严格度
原位杂交实验基本过程
探针标记→纯化→变性
↓
放免
当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞， 探针均采用同位素标记。
发展简史
1981，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针 做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功——荧光杂交技术。
1982，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP） 标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后 用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后 经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针
原位杂交技术ppt课件
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
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2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
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（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
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五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
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去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
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(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
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(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
原位杂交技术原理及其应用讲解学习PPT共60页
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
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原位杂交的原理及应用
原位杂交的原理及应用
原位杂交是分子生物学领域中的一种技术，主要用于检测和定位特定DNA或RNA序列的存在和位置。
这种技术通常使用放射性或非放射性标记的探针来与特定的DNA或RNA序列进行杂交。
原理：原位杂交的基本原理是利用互补配对的原则，将标记探针与被检测的DNA 或RNA样本的靶分子进行杂交反应。
这种技术通常利用一些特定的标记，如放射性同位素或非放射性荧光染料，来标记探针，使其可以在杂交后被检测到。
应用：原位杂交广泛应用于分子生物学和医学领域。
以下是一些具体的应用：
1、检测基因突变。
原位杂交可以检测基因突变或缺失，从而确定某些病理状态的原因。
比如，原位杂交技术可以用于检测肿瘤细胞中激活的癌基因或缺失的肿瘤抑制基因，帮助医生诊断和治疗肿瘤。
2、检测病毒感染。
原位杂交技术可用于检测病毒感染。
例如，在临床诊断中，原位杂交技术可以用于检测人乳头瘤病毒（HPV）感染，从而帮助预防宫颈癌的发生。
3、研究分子发育和进化。
原位杂交也可用于研究分子进化和发育。
例如，在分子系统学领域，原位杂交技术可以用来确定不同物种之间的亲缘关系，并研究其进化历史。
4、研究基因表达模式。
原位杂交还可用于研究基因表达模式，了解基因在生物体中如何发挥作用。
例如，在神经科学领域，原位杂交技术可用于研究神经元中活性基因的表达模式。
总之，原位杂交技术是一种重要的检测和研究分子生物学的方法，具有广泛的应用前景。
原位杂交组织化学幻灯片PPT
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于检测和定位特定的DNA或RNA序列在细胞或组织中的存在和表达。
它通过将标记有特定标记物的探针与待检测的样品进行杂交反应，然后利用显微镜观察探针的位置和数量来确定目标序列的存在和表达水平。
原位杂交技术主要利用探针与目标序列间的互补配对来实现检测和定位，具有高灵敏度、高特异性和显微分辨率较高的优点，因此在生命科学研究和临床诊断中得到了广泛应用。
1.制备探针：探针是一段具有目标序列的DNA或RNA，通常通过聚合酶链式反应（PCR）或转录反应合成。
探针可以标记上荧光染料、放射性同位素或酶等标记物，用于在杂交反应后的检测。
2.样品制备：待检测的细胞或组织样品需要进行预处理，包括固定、脱水、解冻等步骤。
固定样品有利于保持细胞和组织的形态结构，使得探针能够与目标序列发生杂交。
3.杂交反应：将探针与样品进行杂交反应。
反应条件和时间需要根据探针的特性和样品的要求进行优化，包括温度、盐浓度等因素。
4.洗涤：在反应后，需要对样品进行洗涤来去除未杂交的或杂交不牢固的探针，以减少背景信号。
洗涤的条件需要严格控制，以保证背景信号的最小化。
5.检测和观察：使用适当的检测方法，如荧光显微镜、原子力显微镜等，来观察和记录探针的位置和数量。
原位杂交技术的应用广泛，主要包括以下几个方面：1.基因表达：原位杂交可以定位和观察特定基因的表达模式和水平。
通过检测RNA在组织或细胞中的存在和定位，可以研究基因的表达调控机制，揭示转录因子机制、信号通路等重要过程。
2.染色体定位：原位杂交可以在染色体水平上定位特定序列。
通过探针与染色体特定区域的杂交，可以确定染色体的结构和功能，并研究染色体异常与疾病的关系。
3.突变检测：原位杂交可以检测和定位基因突变或基因缺失。
通过使用特异性探针，可以检测DNA序列的缺失、插入或突变，从而提供有关遗传疾病的诊断和研究。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织中检测特定的核酸序列。
它的原理是通过标记的探针与待检测样品中的靶序列发生互补配对，然后通过适当的方法进行可视化。
原位杂交技术广泛应用于基因表达定位、染色体结构与功能研究、细胞分化和发育过程等领域。
1. 探针的选择：根据待检测的靶序列，可以设计相应的DNA或RNA 探针。
DNA探针一般选择长度为100-1000bp的片段，而RNA探针则通常为全长或部分序列。
探针可通过放射性标记或非放射性标记进行标记。
2.可视化标记：常用的标记技术有放射性标记（如32P或35S）和非放射性标记（如荧光染料、酶标记或生物素-亲和素标记）。
不同的标记方式适用于不同的应用领域。
3.杂交条件：为了使探针与靶序列完全匹配，必须优化杂交条件，包括温度、盐浓度、杂交液成分和时间等。
适当的杂交条件可以提高探针与靶序列的互补配对效率。
4.可视化和检测：杂交后，可以根据探针的标记方式选择不同的可视化方法。
放射性标记的探针可以通过暗室放射自显影或闪烁计数等方法进行检测，而非放射性标记的探针则需要使用适当的染色剂或显微镜观察。
1.基因表达定位：通过原位杂交技术，可以在组织或细胞水平上确定特定基因的表达位置。
这对于研究细胞分化、发育和疾病机理等方面具有重要意义。
例如，在肿瘤组织中，可以使用特定的探针定位癌基因的表达位置，从而帮助了解癌症的发生和发展过程。
2.核型分析：原位杂交可以用于染色体结构与功能的研究。
通过将特定探针与染色体的特定区域进行杂交，可以准确地确定染色体的位置和结构，进而了解染色体的功能和相关疾病。
3.细胞分化与发育研究：原位杂交可以用于研究细胞分化和发育过程中的基因表达变化。
通过将探针与分化或发育相关的基因进行杂交，可以确定这些基因在特定阶段的表达模式，从而揭示细胞分化和发育的机制。
4.检测病毒或微生物感染：原位杂交可以被用来检测病毒或其他微生物在细胞或组织中的感染。