原位杂交技术
原位杂交名词解释
原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。
原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。
2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。
3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。
标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。
4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。
5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。
6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。
原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。
它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。
此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。
总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
分子生物学研究中的原位杂交技术
分子生物学研究中的原位杂交技术1. 引言原位杂交技术(In Situ Hybridization，ISH)是一种分子生物学研究中常用的重要技术方法，它在研究基因功能、表达、定位和疾病等方面具有广泛的应用。
通过掌握ISH技术的基础知识和基本操作，可以为分子生物学的深入研究提供强有力的工具。
2. 背景知识ISH技术是通过将DNA或RNA探针与待检测物品（如细胞、组织、染色体等）发生靶向杂交反应，从而探究DNA和RNA序列在待检测物品内的分布、表达及功能等。
利用双链DNA分子中序列互补的特性，ISH技术可以检测同源性的DNA或RNA序列，并确定它们在待检测物品内的位置。
ISH技术有多种类型，其中包括原位DNA杂交（In Situ DNA Hybridization，ISDH）、细胞核流式原位杂交（Fluorescence InSitu Hybridization of Interphase Nuclei，FISH）、原位RNA杂交（In Situ RNA Hybridization，ISR）等。
FISH是目前应用最广泛的一种ISH技术，它能够在细胞核级别上进行检测，解决了ISDH只能检测染色体水平的限制。
3. 原位DNA杂交 (ISDH)ISDH技术是通过从待检测物品中提取DNA标记探针，利用其与待检测物品DNA发生互补杂交来实现。
它能够检测到DNA分子的位置和数量，并确定待检测物品中特定DNA序列的分布。
ISDH的操作步骤主要包括：（1）待检测物品的准备和固定；（2）DNA探针的制备和标记；（3）探针与待检测物品DNA的杂交；（4）洗涤和显色。
4. 细胞核流式原位杂交 (FISH)FISH技术是通过使用荧光探针，将荧光标记的DNA探针与待检测物品的染色体DNA或RNA发生互补杂交反应，直接在细胞核水平上检测DNA序列的位置和数量。
FISH技术不仅能够在正常染色体结构和分布的情况下对基因进行检测，还能够检测基因突变、重排等变异情况。
原位杂交的原理
原位杂交的原理
原位杂交是一种核酸杂交技术，通过将标记有荧光物质的探针与待测样品中的靶标序列进行杂交反应来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的原理基于两种核酸之间的互补配对原则。
DNA或RNA的互补链能够在一定条件下进行杂交，即互相结合形成
双链。
探针是一段由核酸组成的序列，它与待测样品中的目标序列具有互补的碱基序列。
在原位杂交实验中，首先需要制备探针。
探针可以是由DNA
或RNA构成的，其中至少一部分标记有荧光物质。
荧光物质
的标记使得通过显微镜或其他荧光成像设备能够检测到杂交的信号。
探针与待测样品中的目标序列发生互补配对后，形成探针与目标序列的杂交复合物，即探针与靶标序列互相结合。
为了确保探针与目标序列的特异性结合，一般会在杂交反应中使用一些特异性的条件，如控制杂交温度、盐浓度和pH值等。
此外，还可以使用一些核酸结合蛋白的抑制剂来降低非特异性结合。
通过显微镜观察荧光信号的出现位置和强度，可以确定目标序列在细胞或组织中的位置和数量。
常用的观察方式包括荧光显微镜、原位杂交图像分析系统等。
总的来说，原位杂交利用探针与目标序列的互补配对原理，通
过荧光信号的观察来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
这种方法在生物医学研究和分子诊断中具有广泛的应用价值。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交技术
原位杂交技术的特点
光镜或电镜
在保持组织、细胞或染色体结构的条件 下在原位检测特异的核酸分子，这种定位能 够反应特异核酸分子与组织、细胞或细胞器 的关系
原位杂交技术的发展
1969年，Gall等人首次应用原位杂交方法检测 病毒DNA，核糖体DNA
标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP 等等
非放射性标记物
（荧光素 生物素 地高辛 溴脱氧尿嘧啶等）
被导入某个单核苷酸而形成标记分子
如： 四甲基罗达明-UTP
生物素-UTP (Bio-UTP)
地高辛-dUTP (Dig-dUTP)
溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子
变 性 DNA
复
变性的两条互补DNA单链在适当条件
性
下重新缔合成双链的过程称为复性
退火
复性可以发生在导致变性的高温下降的时 候，因此又将复性称为退火
(活细胞内的DNA在进行复制和转录时也存
在着变性和复性的过程)
原位杂交
以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
cDNA双链探针的优点：
⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较稳定，不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
2. RNA探针
RNA是单链分子 （探针长度50-300碱基对）
优点： ⑴ 杂交效率比DNA探针高
⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定
⑶ 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链
原位杂交技术
原位杂交技术原位杂交技术是一种基因分析技术，可以用来研究细胞内基因的表达模式和基因组的结构。
本文将介绍原位杂交技术的基本原理、应用领域以及未来发展方向。
原位杂交技术最早是在20世纪70年代发展起来的，主要用于研究DNA在细胞中的位置和分布情况。
其基本原理是利用亲和性标记的探针与目标DNA序列特异性结合，通过显色或荧光等方法来检测标记物的位置。
原位杂交技术的具体步骤包括控制组织或细胞的形态、固定样本、渗透处理、杂交、洗脱、显色和观察等。
其中最关键的步骤是杂交反应，需要合理设计探针的序列和标记方法，并进行适当的条件优化。
原位杂交技术广泛应用于生物医学领域，可以用于寻找新的基因、研究基因的表达调控机制、探索基因组的结构与功能等。
例如，科学家可以用这种技术来研究染色体异常、肿瘤基因的异常表达、发育过程中的基因调控等。
此外，原位杂交技术在遗传学、生物学、植物学、动物学和微生物学等领域也有广泛的应用。
在遗传学中，可以用原位杂交技术检测并分离具有特定基因型的个体；在植物学中，可以研究植物的组织分化和发育过程；在动物学中，可以研究胚胎发育和器官再生等。
虽然原位杂交技术在基因研究中起到了重要作用，但仍存在一些局限性和挑战。
首先，该技术的灵敏度和特异性受到探针选择、探针标记和杂交条件等多个因素的影响。
其次，原位杂交技术在细胞外不易实施，因为固定和渗透处理可能会对细胞和组织结构产生破坏。
未来，随着生物技术的不断发展，原位杂交技术也将得到进一步改进和完善。
例如，可以利用新型的标记物和探针来提高技术的敏感度和特异性，同时也可以开发新的杂交方法来降低对样本的破坏。
此外，结合其他高通量分析技术，如转录组学和蛋白质组学，可以更全面地揭示基因表达和调控的网络。
总之，原位杂交技术是一种重要的基因分析技术，可以揭示细胞内基因的表达模式和基因组的结构。
在今后的研究中，我们有理由相信原位杂交技术将发挥更大的作用，并帮助科学家们更好地理解生命的奥秘。
18 原位杂交技术
基本内容
一、原位杂交的基本原理 二、原位杂交的分类 三、发展起的新技术 四、原位杂交的特点 五、基本步骤 六、在遗传学研究中的应用 七、课堂小结 八、作业
一、原位杂交的基本原理
原位杂交是基于DNA分子变性和复性原理而发展起 来的一种技术。两条不同来源的但具有同源性的核苷 酸单链片段在适宜的条件下能够按照碱基互补配对原 则通过氢键相互结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双链分子。
用蛋白酶K酶解以增大材料的渗透性并除去与DNA 粘连且抑制探针杂交的蛋白 。
五、原位杂交的主要步骤
2.杂交液的配制
杂交液所含成分除大约2.5 ng/ul的标记探针DNA外，还包括 ：
50%甲酰胺，是解双螺旋的分子，会破坏氢键的形成，促进 DNA和探针变性后，进行杂交； 10%硫酸葡聚糖，形成探针混合液基质，对DNA有浓缩作用 ，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强 度；杂交时常用浓度为5%～10%，但浓度高时会使溶液的粘 度增大，不利杂交探针的渗透。 0.1SDS,它有助于探针的渗透; 2×SSC,作为调节探针洗脱强度的缓冲液; 封阻DNA：浓度通常为探针DNA的1～100倍,作用是杂交掉探 针中的相似序列，阻止探针DNA与非目标DNA的粘连，即用于 阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。
皮生长因子受体2（HER2）基因的扩增和蛋白过度表 达，HER2过度表达的乳腺癌浸润性强，无病生存短， 预后差。另外，HER2 的状态是乳腺癌药物（蒽环类 药物和曲妥株单抗）治疗的主要参考指标，其中曲妥 珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆 抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部分，适用于治 疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2过度表达或 HER2基因扩增的乳腺癌患者用赫赛汀治疗才有效，因 此检测HER2的状态对于赫赛汀的用药指导非常重要。 目前临床上，荧光原位杂交技术被认为是检测HER-2 状态的金标准。
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1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对） 优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
2. RNA
RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）
优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高
DNase I在DNA双链上造成单链切口 DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切 口处将旧链从5末端逐步切除 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将 dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新 的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入
②随机引物法
随机引物能与各种单链DNA模板结合
DNA聚合酶按53方向合成一新的 DNA链。 带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA 分子中
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是 RNA ）不 被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态 结构。 基本与免疫组织化学技术相似。 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制 处理的器具接触标本
标本的储存 所使用的容器 、刀具等均经高压消毒或清洁后 用 DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，臵4℃冰箱内2-4小时。
再将组织移入 30 ％蔗糖 PBS 溶液内， 4℃冰箱内过夜。
次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。
组织制片 冷冻切片以厚5~30um最佳。
40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱
在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存数月之久 石蜡切片，一般不提倡浸入二甲苯溶液。
(三)杂交预处理
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern
印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致
靶核酸分子
地高辛标记探针
碱性磷酸酶联结的 抗地高辛抗体
(七)原位杂交详细步骤 1、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。DEPC水洗2次， DEPC-PBS洗2次，5分钟 2、DEPC-PBS处理的Triton-X100处理15分钟 3、DEPC-PBS洗2次，5分钟
4、TE缓冲液稀释的蛋白酶K（5-20μg/m l）37℃
（一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的
石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA 原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方 法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA
作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要
注意预防
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时） 对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒
却，以保持变性后单链状态。
3. 杂交液的组成 探针——预变性的探针 高浓度盐类(柠檬酸钠)——增加杂交体的稳定性 甲酰胺——可降低解链温度 硫酸葡聚糖——对 DNA 有浓缩作用，可提高杂交 的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度 牛血清白蛋白和鲑鱼精 DNA 或 RNA——用于阻止 探针与非特异位点或非目标DNA杂交。
4. 温度、时间和PH 方法：杂交液滴于切片上，加盖硅化的盖玻片。 杂交的温度：在Tm-25℃左右，大约在30～60℃之间 时间：16－20小时，一般过夜。 PH：6.5－7.5
含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时，杂交温度：
DNA探针是42℃
RNA探针是50-55℃
寡核苷酸探针是37℃
1. 切片脱蜡及水化
脱蜡及水化过程与普通石蜡切片相同
要求：脱蜡要彻底，否则影响探针对组织细胞 的穿透 RNA杂交: 需DEPC水替代蒸馏水稀释酒精 切片入DEPC水浸泡
2.增强标本通透性与核酸探针穿透性
常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐
处理和稀酸洗涤等
(1)蛋白酶K（甘氨酸）、胃蛋白酶（4％多聚
2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC )
RNA酶抑制剂，有毒
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏 水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
(五)杂交后处理 目的：尽可能洗去未杂交或非特异性吸附的探针。 方法：系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 RNA探针杂交后漂洗液中的可加入RNA酶 原则：是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高
(六)杂交体的检测
生物素标记的探针 酶标记卵白抗生物素抗体 酶标记链霉抗生物素抗体连接 地高辛标记的探针 酶标记抗地高辛抗体 标记酶：HRP、AlP
杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮
或脱片
2. 杂交信号弱 探针链太长不易深入细胞 探针的标记不好 靶序列暴露程度不佳 探针和（或）靶序列的变性条件欠佳
3. 无杂交信号 标本内无靶序列的存在 标本内存在靶序列，因实验某个环节的失 误导致后者可能降解
4. 非特异性着色 探针特异性 组织细胞内的内源性酶 组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体非 特异性结合
(2)RNA探针标记
在体外转录技术中与探针制备同时完成
(3)寡核苷酸探针标记 末端转移法
三、原位杂交技术的基本步骤
观察、照相
取材Hale Waihona Puke 切片C C C C C C
显色
杂交
原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的
包括：组织和器材的特殊处理 取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析
常用免疫酶学显色检测方法有两类：
Dig-HRP检测系统
以DAB/H2O2为底物，结果为棕色；
以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。
Dig-AKP检测体系
以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
Diao HL. 2007. Fertil & Steril
地高辛
在植入期子宫中的定位
2. 标记方法 (1)DNA探针标记 ①切口移位法
小结
基本实验过程总结 探针制备、标记 →纯化 →变性
↓ 原位杂交 →杂交体探测： ↑ 放射自显影 样品制备 →切片 →通透处理 免疫细胞化学
Thank you！
常用试剂
1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA） 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容 器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃， 使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH调pH值至7.0， 使呈清亮状，再加入约500ml 2×PBS，充分混匀（在 冰浴或冷水浴中），可再检测一下 pH，过滤后定容 至1000ml，室温或4℃保存备用。
杂交温度下预先孵育切片，以达到封闭或阻
断与核苷酸探针产生非特异性杂交点，降低
背景着色的目的。
(四)杂交反应 标记的探针与检测标本上的靶序列结合而形成杂
交体的过程。 这是原位杂交技术的关键步骤。 包括：探针的准备 双链核酸的变性 杂交反应
1. 探针准备 探针长度：50－100个碱基最佳
探针标记物：地高辛（DIG）
复性
RNA
DNA
二、探针（probe）
(一)定义：
是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或
RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞
内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，
探针的碱基序列是已知的，只能与特定的
核酸分子结合上
(二)探针的分类 根据探针的核酸性质分为
DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、
标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照
阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性
阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性
对照实验设臵愈多，实验结果的可靠性就愈大。
注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照
常用的实验对照 (1)标本对照：选用已知为阳性或阴性的组织 (2)空白实验: 无探针的杂交液进行杂交 (3)选用其他生物学方法进行对照实验
特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时
短，标记探针可较长时间的保存和使用
地高辛（Digoxigenin 简写Dig-）
类固醇半抗原分子
人及多种动物体内不存在类似的物质，无交 叉反应
特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似
较放射性标记系统安全，方便、省时间
定位准确，杂交背景好
地高辛标记探针的显色检测
探针浓度：0.5－5.0μg/ml;
杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜
2. 探针和靶核酸变性 当靶核酸或探针为DNA时，杂交前需要变性为单链 理论热变性温度：90℃－95 ℃
甲酰胺法：常规的加入30～50%甲酰胺于杂交液中
每增加1%，Tm值降低0.72℃，降至37-40 ℃为宜
注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷
注意：①配制时应在通风条件下操作，并避
免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因 PFA 有
孵育15～20min
5、用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗1min 终止蛋白酶K的消化，DEPC-PBS洗2次，5分钟 6、DEPC-PBS-4%多聚甲醛后固定 10-15分钟 7、DEPC-PBS洗2次，5分钟
8、2×SSC洗5分钟
9、不含探针的杂交液中37℃孵育2h
10、2×SSC洗5分钟
形态学实验技术