原位杂交实验操作步骤
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交实验方法
1，预杂交液和杂交液的配制 2，20Xssc， 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液的配制 3，0.1mol PBS缓冲液的配制 4，0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制 5，0.1mol TBS缓冲液的配制 6，复合消化液的配制 7，组织细胞打孔液的配制 8，杂交漂洗液 9，过氧化氢封闭液
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探针设计方案
1，探针名称 ： 2，适用种属： 3，标记方式：3ˋDIG 4，模板序列： 5，探针序列：
5ˋFAM
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探针杂交原理
1，组织细胞的通透 2，探针长度 3 , 探针浓度和杂交时间 4，杂交中的Tm值和杂交温度 5，杂交严格度 6，预杂交原理 7，杂交后处理
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A-石蜡切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法
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B-冰冻切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统
二，碱性磷酸酶显色系统
三，荧光显色方法
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C-细胞爬片或涂片mRNA原位杂交步 骤
一，过氧化物酶显色系统 二，碱性磷酸酶显色系统 三，荧光显色方法
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附录
1，DAB的配制和使用方法2NBT/BCIP的配制和使用方法
3，苏木素的配制和使用方法
4，核固红的配制和使用方法
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流式细胞仪
D-悬浮细胞的mRNA原位 杂交细胞流式细胞仪步骤
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原位杂交实验方法
适用方法 荧光检测系统 过氧化物酶检测系统 碱性磷酸酶检测系统
石蜡切片
冰冻切片
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细胞涂片和 细胞爬片
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mRNA 原位杂交前实验准备
1，无RNA酶水的处理 2，无RNA酶载玻片的处理 3，标本的防RNA酶的固定 4，探针的稀释和保存 5，DNA探针需变性
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交步骤-自己整理的1
原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。
（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
完整版Fish实验
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
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原位杂交实验操作步骤一质粒制备1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。
2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3.轻轻摇匀，冰浴30min。
4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。
2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。
3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。
6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。
恒压50V，进行电泳。
7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中，于37℃，200转/分培养3h。
2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37℃，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170μ/ml)。
37℃，200转/分培养12-16h。
4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4℃离,th,15min，沉淀细菌。
5.弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。
7.加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。
8.6000rpm，4℃离心15min，保留上清。
9.将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。
(或-20℃4h，或4℃过夜，可便核酸沉淀)10.12000rpm，4℃离心15min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。
13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混匀。
12000rpm，4℃离心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000rpm,4℃离心15min，回收核酸。
小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。
18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混匀，4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。
19.加入400μlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30min。
21.于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。
尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22.加入400μl处于4℃的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4℃12000rpm离心2min。
23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24.用100μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。
OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(μg/μl)。
26.质粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探针的标记1.将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3.进行体外转录，步骤如下：4.在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。
三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1. 将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。
将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。
2. 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO min。
3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA (乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。
(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7. 5 x SSC中平衡15 min。
3.2杂交8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片)，置于放有湿盒液(50% 甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。
9. 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
3.3杂交后处理1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4杂交信号检测13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15.用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。
在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18.充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21.脱水、透明，用中性树胶封片。
22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。
探针标记方法有①DNA的缺口平移法。
缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。
该技术可以制备序列特异的探针。
当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。
但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。
此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。
②DNA的随机引物法。
这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。
这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。
由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。
DNA片段的大小不影响标记的结果。
标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。
标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。
随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。
随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。
③RNA的体外转录法。
体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。