原位杂交操作流程
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交
原位杂交实验能否成功的要点之一是待 能否在加入探针前得到有效保护。 测mRNA能否在加入探针前得到有效保护。 能否在加入探针前得到有效保护 原位杂交实验技术的杂交前多个处理环节 如组织取材、保存、切片等） （如组织取材、保存、切片等）存在污染 RNA酶的机会，易造成待测 酶的机会， 损失， 酶的机会 易造成待测mRNA损失，导 损失 致实验失败。 致实验失败。 此外， 此外，杂交后示踪系统与特异标记探针 的结合以及非特异反应的封闭等环节， 的结合以及非特异反应的封闭等环节，也容 易发生问题。 易发生问题。
9. 30%、60%、80%、95%、100%乙醇各 min 乙醇各2 、 、 、 、 乙醇各 10. 含探针杂交液 含探针杂交液10ul(2ng/ul),加盖片 37℃过夜 加盖片, 加盖片 ℃ 去盖片,50%甲酰胺 ×SSC 37℃ 15 min, 2×SSC 甲酰胺/2× 去盖片 甲酰胺 ℃ × 37℃ 15 min, ℃ 12. 1×SSC 室温 15 min × 13. 4×SSC 室温平衡 min, 吸去残余缓冲液 勿干涸 室温平衡5 吸去残余缓冲液(勿干涸 勿干涸) × 14. 封闭液 封闭液(200ul),加盖片 湿盒 37℃ 30 min 加盖片,湿盒 加盖片 湿盒, ℃ 15. Anti-DIG-Biotin 200ul,盖玻片 湿盒 ℃,30min 盖玻片,湿盒 盖玻片 湿盒37℃ 16. 17. 18. 19. 20. 42℃,0.1%Tween 20 /PBS 摇洗 min×3 ℃ 摇洗5 × SABC-POD 200ul,盖玻片 湿盒 ℃,30min 盖玻片,湿盒 盖玻片 湿盒37℃ 42℃,0.1%Tween 20 /PBS 摇洗 min×3 摇洗5 ℃ × DAB 200ul,盖玻片 室温 暗处 盖玻片,室温 暗处,10-20min 盖玻片 室温,暗处 PBS 5min(终止反应 复染 终止反应),复染 甘油封片. 终止反应交实验方法: 简便的外周血白细胞原位杂交实验方法
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交操作流程3
原位杂交操作流程：步骤备注材料的固定和包埋1、固定：将花芽浸入20倍于材料的FAA固定液中，抽气除去材料表面附着的气泡直至材料沉于容器底部，4 °C过夜（24h-72h），然后保存于70%乙醇中。
100mlFAA固定液包含：乙醇50 ml 冰醋酸 5 ml 37% 甲醛溶液10 ml DEPC-H2O 35 ml2、脱水：材料经70%，80%，90%，100%，100%，100%乙醇脱水，每步60分钟。
3、透明：依次经25%二甲苯-75%乙醇，50%二甲苯-50%乙醇，75%二甲苯-25%乙醇，100%二甲苯，100%二甲苯，100%二甲苯，每步45分钟。
4、浸蜡：50%石蜡-50%二甲苯，42°C处理24h，重复此操作一次，移入60°C温箱，换入纯石蜡，60°C保温四天，每天换两次纯石蜡60°C石蜡过滤，超过62°C可能会破坏石蜡结构5、包埋：包埋时注意除气泡石蜡包埋块4°C可以保存1年以上切片1、载玻片：使用进口的处理好的载玻片。
2、切片展片：42°C粘片四天。
探针标记1、转绿反应（10µl）：线性化模板200-300ng（2µl）5x Transcription Buffer 2µl5x Labeling Mix 2µlRNApolymerase 1µlDEPC-H2O 2.5µlRnase Inhibitor 1µl37 °C or 42°C反应2小时2、收集探针：1µl 10mg/ml tRNA2.5µl 4M Licl75µl 100%乙醇，-20°C放置2小时，4°C，1,2000，30分钟70%乙醇洗涤沉淀，风干，溶于50µl DEPC-H2O中。
为使探针彻底溶解，可以在60°C 保温15分钟3、探针半定量：不同稀释倍数的探针和标准品点同样体积于尼龙膜，按照说明书进行显色。
原位杂交步骤整理
1.石蜡切片：每组一个蜡块，切片厚度5-6μm
2.脱蜡入水
3.DEPC水洗5min*2（1500ul/1500ml）
4.蛋白酶K消化，37℃，10-15min，DEPC水洗5min。
5.2×SSC平衡20min*1,DEPC 5min*2
6.42℃预杂交2h，切片上每个组织50μl，湿盒内（至少30min）(冰柜里面放的白色的液体就是预杂交液，标的H的）
7.沸水中变性探针，5min，立即冰浴（防止探针复性），放冰盒内（用预杂交液稀释）
8.稀释探针浓度为1-8ng/μl，(3ng/ul左右)切片上每个组织30μl，42℃过夜，湿盒内A:56ng/ul
9. 2×SSC洗两次，每次 5min
10.0.5×SSC洗两次，每次15min
11.马来酸洗一次，5min。
12.封闭液（由TBS溶解粉剂至1%）孵育60min，不洗。
（用马来酸稀释封闭液1:9）100/900(冰柜黄色液体)
13.用封闭液稀释生物素化抗地高辛抗体：混匀后50μL/片加至标本片上。
置样品于湿盒中，37℃反应120分钟。
0.5/500(上面稀释好的)
14.马来酸洗10分钟×3次。
15.detection buffer 5min*1
16.nbip 显色1ml加20μl（用detection buffer 稀释）时间3个小时以上。
（避光）
17.苏木素轻度复染。
蒸馏水洗。
脱水，透明，封片。
rna样品原位杂交流程
rna样品原位杂交流程RNA样品原位杂交是一种用于分析RNA分子在组织或细胞中位置和表达水平的实验技术。
该技术的应用广泛，可以帮助科学家们了解基因表达模式、发现新的基因调控机制以及研究疾病的发生机制。
本文将详细介绍RNA样品原位杂交的流程，并一步一步回答相关问题。
第一步：样品准备在进行RNA样品原位杂交实验之前，首先需要准备好所需的样品。
这通常包括组织切片或细胞培养物。
对于组织切片，可以通过组织切片仪将组织切割成适当的薄片。
对于细胞培养物，可以通过离心将细胞从培养容器中收集起来。
问题1：为什么需要准备样品？样品的准备是RNA样品原位杂交实验的基础。
只有准备好的样品才能正常进行后续的实验步骤。
第二步：固定样品在进行RNA样品原位杂交实验之前，需要使用适当的方法将样品固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、甲醛或细胞固定试剂等。
固定样品的目的是保持样品的形态结构，并防止RNA分子的降解。
问题2：为什么需要固定样品？固定样品可以使细胞或组织的结构保持完整，同时保护RNA分子不被降解。
第三步：蛋白酶消化固定的样品往往含有多种蛋白质，这些蛋白质会干扰RNA杂交的过程。
因此，在进行RNA杂交实验之前，需要使用蛋白酶消化来去除细胞或组织中的蛋白质。
常用的蛋白酶包括蛋白酶K和胰蛋白酶。
问题3：为什么需要进行蛋白酶消化？蛋白酶消化可以降低蛋白质的干扰，提高RNA杂交的灵敏度。
第四步：RNA杂交反应在固定样品的基础上，进行RNA杂交反应是RNA样品原位杂交实验的核心步骤。
在这一步骤中，首先需要制备适当的RNA探针。
RNA探针是用于杂交的RNA分子，通常使用具有标记的RNA分子，如荧光标记的RNA 或酶标记的RNA。
问题4：什么是RNA探针？有什么作用？RNA探针是用于杂交的RNA分子，可以通过与RNA样品发生互补配对来检测RNA的位置和表达水平。
制备好的RNA探针会与待测RNA样本杂交，形成稳定的双链结构。
杂交反应可以在一定的温度和时间条件下进行。
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原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2×SSC清洗10分钟；21）37℃，1×SSC清洗10分钟；22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2×SSC清洗10分钟；18）37℃，1×SSC清洗10分钟；19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
FISH步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。
把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。
切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
地高辛标记寡核苷酸探针1．组织处理（1）冷冻切片：厚10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。
切片保存于-80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。
PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。
（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10min ×2，空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度。
PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
（3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗。
在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。
在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。
孵育在2×SSc 10min。
2．探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo -）探针，3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。
3．预杂交和杂交加约300μl预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。
如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。
（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。
如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。
（2）预杂交后以2×SSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30μl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37℃过夜。
如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。
次日室温2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室温），0.5×SSc 37℃洗半小时，0.5×SSC室温漂洗半小时。
4．地高辛显示。
地高辛标记cRNA探针1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10～30μm）最佳。
切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。
经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。
但仍以新鲜制片为好。
如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。
一般不提倡浸入二甲苯溶液。
但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。
经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。
在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。
下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1）PBS洗2×3min。
（2）选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。
其它切片暂放于PBs 内。
RNA酶对照片处理方法：加RNA酶（100μg/ml）在预热37℃的溶液内。
放在潮湿的盛有少许2×SSC 塑料盒或蒸发皿内。
在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。
（3）蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。
消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。
时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。
（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。
0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6）以PBs 漂洗2×3min。
（7）浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封闭非特异性结合部位。
（8）2×SSC漂洗15min。
2．杂交以含cRNA探针（0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片10～2μl的量覆盖切片。
地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。
覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC 温盒内在42℃，16～18h或过夜。
3．显示（1）用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。
（2）在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。
（3）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。
加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1：500，以缓冲液1稀释），孵育2h，室温。
（4）缓冲液1漂洗3×3min。
（5）浸入缓冲液210min室温。
（6）浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色BCIP/NBT，室温。
最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。