原位杂交实验操作步骤
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍分子生物学是一门研究生物分子结构、功能和相互作用的科学。
原位杂交技术是其中一种常用的实验方法，用于研究DNA或RNA在细胞或组织中的位置和表达情况。
本文将介绍原位杂交技术的使用方法，包括样品准备、探针设计、杂交条件和信号检测等方面。
一、样品准备在进行原位杂交实验前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞、组织或整个生物体。
对于细胞和组织样品，需要进行固定和切片处理。
固定可以使用甲醛或乙醛等化学试剂，切片则需要使用显微刀或切片机。
对于整个生物体样品，需要进行组织切片或冰冻切片处理。
二、探针设计探针是原位杂交实验中的重要部分，用于与目标DNA或RNA序列特异性结合。
探针可以是DNA或RNA，通常标记有荧光染料或放射性同位素。
在设计探针时，需要考虑目标序列的长度、GC含量、互补性和特异性等因素。
同时，还需要选择适当的标记方法和标记物，以便在实验中检测到探针的信号。
三、杂交条件杂交条件是决定原位杂交实验结果的关键因素之一。
杂交温度、盐浓度和杂交时间等参数需要根据目标序列的特性进行优化。
通常情况下，较高的杂交温度和适当的盐浓度有助于提高探针与目标序列的互补性结合。
杂交时间一般在数小时到数天之间，具体根据实验需要进行调整。
四、信号检测信号检测是原位杂交实验中的最后一步，用于观察和记录探针与目标序列的结合情况。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、放射性计数和原位杂交染色等。
荧光显微镜观察是最常见的信号检测方法，可以通过荧光染料的发射和目标序列的位置来确定探针的结合情况。
放射性计数则是使用放射性同位素标记的探针进行测量，通过探针的放射性衰减来判断探针与目标序列的结合情况。
原位杂交染色是一种较为传统的信号检测方法，通过染色剂与探针结合来观察目标序列的位置和表达情况。
原位杂交技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究基因表达、基因定位、基因组结构和染色体变异等方面。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，原位杂交技术可以提供有关生物分子在细胞和组织中的空间分布和功能调控的重要信息。
原位杂交步骤-自己整理的1
原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。
（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交
原位杂交原位准备工作：1、不锈钢与玻璃器皿180度烘12小时以上2、需DEPC处理的三蒸水约8升（听说可以用灭菌三蒸水代替）3、双蒸水可以用一馏水（即蒸馏水）代替4、所用枪头可以灭一个小时烘干用（也可用烘好的移液管）5、所用蜡片温度不能过高，防止材料变形6、切片一定要尽量吸干，并且烘12小时以上（但不能过长），以防脱落7、实验所需试剂的量要略作变动，大缸约600ml，小缸约500ml8、所有试剂除储备液外，最好都现配现用，请备好足够的烘好的量筒及容器最后强调杂交之前配试剂、融蜡与加蜡所用一切器皿器具都要180度处理，请戴乳胶手套（尽量避免接触其它地方）以防组织RNA降解下次做需买的东西：1、t RNA（一个100u的加50ul水，较粘稠吸取时应慢些，并看一下是否吸到）2、BSA（一次约需15克）3、多聚甲醛（一次约需20克）4、非去离子甲酰胺（一次约需200多ml）5、RNAse（实验室可能有）6、最好领2个2L的三角瓶7、乳胶手套8、无水乙醇（一次约需12瓶，有些地方应该可以95%的代替）做之前请认真检查所需一切用品是否到位I．组织固定和包埋在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。
FAA固定液（400ml），室温保存：无水乙醇 200ml冰醋酸 20ml37%甲醛 40ml水（DEPC） 140ml1L水加1mlDEPC，37℃过夜（最好一直慢摇或剧烈摇晃后再放入），灭菌第一天：组织固定（下午4、5点取材）将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料投入，冰上真空抽气。
缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。
换新鲜固定液，4℃过夜（12～16小时）。
（用DEPC-H2O配酒精）第二天：脱水以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。
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原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
1.2 溶液配制0.1M PB缓冲液：Na2HPO4•12H2O 5.8021g,NaH2PO4•2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。
以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。
多聚甲醛（PFA）溶液：向配制好的有磁力搅拌子的0.1M PB缓冲液中加入8g PFA，60℃加热搅拌，并加入几粒NaOH颗粒，直至完全溶解。
20％蔗糖溶液：向另一瓶配制好的0.1M PB缓冲液中加入40g蔗糖，完全溶解。
2.取新鲜组织用事先烘烤过的剪刀和镊子（冷却至室温），选取合浦珠母贝新鲜外套膜、腮、闭壳肌等组织，迅速放入配好的4％多聚甲醛（PFA）溶液中，取组织的过程应戴口罩、一次性手套，尽量避免污染和减少RNA降解。
3.组织固定、脱水（1）将选取的组织在4％多聚甲醛（PFA）溶液中固定5～6h。
（2）用预先烘烤好的镊子将固定好的组织夹入20％的蔗糖溶液中，于4℃沉淀，直至组织块完全沉到瓶底（20h以上）。
4.冰冻切片切片在冰冻切片机上进行，生物系张秀芳老师实验室就有冰冻切片机，一般按工作时间收费，需提前预约。
切片之前将组织切成小块（按照研究要求的方向）后放在固定盘上，用专用胶将组织块完全包围，然后放入冰冻切片机里的制冷区冷凝，待组织块完全冷凝后将盘放于切片区的操纵杆上准备切片。
切片的厚度一般调至10ūm。
将切好的组织粘到盖玻片上用多聚赖氨酸处理过的一面（切忌贴到反面），同时在毛玻璃的一面用铅笔做好标记。
每张玻片上贴5～6个切片，可以是几种不同的组织。
将切完的玻片放在冰上，干燥一段时间后，放于－20℃保存。
切片的质量可以用显微镜进行检验。
（二）RNA探针标记1、将目的片段（用于标记的DNA片段，300bp以上）连接到T载体上，如PGEM-T easy 载体（转录启动子为T7和SP6），转化到大肠杆菌JM109细胞中，摇菌，提取质粒，质粒浓度尽可能大。
2、质粒线性化：将提取的质粒用载体上靠近SP6端的特异性酶（目的片段和T7端不能含有，只有SP6端有的酶切位点），如NdeI，于37摄氏度酶切10h以上。
3、琼脂糖凝胶电泳检验线性化以后的质粒，须为一条平直的条带，并利用DNA Marker确定质粒的大致浓度。
4、探针标记及纯化（1（2）37摄氏度放置2小时，然后加入2ul 3mol/L 醋酸钠和10ul 异丙醇。
（3）－20摄氏度放置2小时，然后4摄氏度12000g 离心30分钟，弃上清。
（4）50ul 70％预冷乙醇洗一次，7500g 离心5分钟，弃上清。
（5）晾干沉淀，溶于10ul无核酸酶的水中。
（6）取0.5ul作RNA凝胶电泳，其余-20摄氏度保存备用。
（三）原位杂交1、实验准备1.1器具准备镊子两把，100ml量筒一个，染色缸三个（依杂交的玻片数量来确定，每个染色缸可以同时放5张玻片），100ml试剂瓶一个，1000ml试剂瓶三个，200ml试剂瓶三个。
以上器具都在180℃以上的温度烘烤6h以上。
吸水纸，湿盒一个，杂交炉一个。
1000μl、200μl和20μl枪头各若干，121℃高压灭菌25min以上。
1.2溶液配制DEPC水：1000mldd H2O中加入1ml DEPC，充分摇匀，于室温过夜，高压灭菌。
考虑到DEPC水用量较大，一般同时准备两瓶DEPC水。
3％柠檬酸：100mlDEPC水中加入柠檬酸3g，PH2.0左右。
2×SSC：1000ml DEPC水中加入NaCL17.6g，柠檬酸三钠8.8g。
0.5×SSC：150ml DEPC水中加50ml 2×SSC即可。
0.2×SSC：80 ml DEPC水中加120ml 0.5×SSC即可。
0.5M TBS：1000ml DEPC水中加NaCL30g，Tris 1.2g，纯乙酸0.4－0.5ml，PH7.2-7.6。
0.01M TBS（PH9.0-9.5）：1000mlDEPC水中加入NaCL9g，Tris 1.2g。
2、杂交步骤（1）灭活内源性碱性磷酸酶（AP）：将切片用20％的乙酸处理10min，以灭活内源性的碱性磷酸酶。
（2）暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化90－120秒。
0.5M TBS洗3次×5分钟，DEPC水洗5分钟。
（3）预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部垫上吸水纸，用蒸馏水充分润湿。
按照每张切片20μl加预杂交液。
40℃恒温3小时，吸取多余液体，不洗。
（4）稀释探针：将用地高辛标记好的RNA探针于65℃加热变性8min，用杂交液稀释为2μg/ml。
（5）杂交：每张切片加20μl稀释好的探针，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，50℃杂交过夜。
（6）杂交后洗涤：揭掉盖玻片，2×SSC洗5min×3次。
（7）消化残余的RNA：用2×SSC稀释RNase A 到20μg/ml，处理30min。
（8）洗涤：2×SSC于37℃洗涤10min×3次；0.5×SSC室温洗涤5min×3次；0.2×SSC室温洗涤5min×3次。
（9）滴加封闭液：37℃处理30min，吸去多余液体，不洗。
（10）滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃处理1h，0.5M TBS洗涤5min×4次。
注意：勿用其它缓冲液或水洗。
（11）滴加SABC-AP：37℃处理30min，0.5M TBS洗涤5min×4次。
注意：勿用其它缓冲液或水洗。
（12）BCIP/NBT显色：用0.01M TBS将BCIP/NBT稀释50倍，混匀。
显色液加至标本上，一般37℃下避光显色20min。
若无背景出现可继续显色。
用DEPC水充分洗涤。
（13）水溶性封片剂封片。
附I DNA探针处理方法用DNA做杂交探针的话，处理方法如下：1.将目的片段（用于标记的DNA片段，300bp以上）用无菌双蒸水稀释至16μl。
2.将稀释好的DNA用沸水浴（100℃）10min，冰上3min以上变性。
3.加4μl事先摇匀的DIG-High Prime，混匀，2000rpm离心5min。
4.37℃反应2h以上，通常过夜至20h。
5.加2μl0.2M EDTA(PH8.0)中止反应或65℃加热10min中止反应。
6.－20℃保存（一般可以保存一年）。
附II 过氧化物酶（POD）检测（MK1030型）试剂盒原位杂交操作步骤一、溶液配制1、DEPC水：1000mldd H2O中加入1ml DEPC，充分摇匀，于室温过夜，高压灭菌。
考虑到DEPC水用量较大，一般同时准备两瓶DEPC水。
2、3％柠檬酸：100mlDEPC水中加入柠檬酸3g，PH2.0左右。
3、2×SSC：1000ml DEPC水中加入NaCL17.6g，柠檬酸三钠8.8g。
4、0.5×SSC：150ml DEPC水中加50ml 2×SSC即可。
5、0.2×SSC：80 ml DEPC水中加120ml 0.5×SSC即可。
6、0.5M PBS：1000ml蒸馏水加NaCL30g，Na2HPO4•12H2O 6g，NaH2PO4•2 H2O 0.4g，PH7.2-7.6。
二、原位杂交操作(1)灭活内源性过氧化物酶（POD）：将切片用0.5％H2O2/甲醇室温处理30分钟以灭活内源性的过氧化物酶，后用DEPC水洗3次。
(2)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化90－120秒。
0.5M TBS洗3次×5分钟，DEPC水洗5分钟。
(3)预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部垫上吸水纸，用蒸馏水充分润湿。
按照每张切片20μl加预杂交液。
40℃恒温3小时，吸取多余液体，不洗。
(4)杂交：每张切片加20μl稀释好的探针，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，42℃杂交过夜。
(6)杂交后洗涤：揭掉盖玻片，2×SSC于37℃洗涤10min×3次；0.5×SSC室温洗涤5min×3次；0.2×SSC室温洗涤5min×3次。
(7)滴加封闭液：37℃处理30min，吸去多余液体，不洗。
(8)滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃处理1h，0.5M PBS洗涤5min×4次。
注意：勿用其它缓冲液或水洗。
(9)滴加SABC：37℃处理20min，0.5M PBS洗涤5min×4次。