原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶（AP）检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶（AP）检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶（AP）检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等, 切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交步骤自己整理的精讲原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。
这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。
下面是原位杂交的详细步骤：1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。
这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。
细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。
蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。
这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。
在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。
常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。
标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。
这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。
杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。
反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。
常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。
通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。
例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。
总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种重要的遗传学技术，用于研究基因组的结构、组织和表达。
它可以帮助科学家确定特定基因在染色体上的位置，探索基因在细胞和组织中的活性等信息。
本文将详细介绍原位杂交技术的操作步骤，并分享一些实验中常见的小贴士。
原位杂交的基本原理是将一段与所研究基因序列互补的DNA探针标记上荧光分子等信号物质，然后与待测细胞或组织样品进行杂交反应。
通过观察探针与靶DNA的结合情况，可以确定所研究基因在染色体的位置和组织中的表达情况。
下面是一般的原位杂交实验步骤：1.样品处理：首先，需要准备待测细胞或组织样品。
可以选择直接从动植物或细菌中提取DNA，或采用组织切片的方式。
样品处理的目的是提高探针与靶DNA的结合效率。
2.探针的制备：制备一段与所研究基因互补的DNA探针。
可以通过PCR扩增、化学合成或转录反应等方法制备探针。
为了方便后续观察，可以将探针标记上荧光物质如荧光染料、辣椒素或金纳米颗粒等。
3.免疫组化：为了提高探针与样品中的靶DNA的杂交效率，可以进行免疫组化步骤。
这一步主要是使用特定抗体识别并结合待测物质，如甲醛固定、蛋白酶K处理等。
4.模板DNA的制备：将样品中的DNA固定在载玻片上，通常使用甲基化醛或戊二醛确定DNA在载玻片上的位置。
5.杂交反应：将制备好的探针与固定在载玻片上的DNA进行杂交反应。
这一步通常需要对探针和靶DNA进行变性和再结合等步骤。
6.信号检测：通过显微镜观察杂交产物，在适当的波长下观察荧光信号。
可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备。
接下来，我们来分享一些原位杂交技术的小贴士：1.设计合适的探针：选择合适的探针非常重要。
探针的长度应该足够长，以确保与靶DNA的特异性结合。
此外，为了提高信号强度，可以选择多个标记物如荧光染料标记在同一个探针上。
2.优化杂交条件：杂交时间和温度是影响杂交效率的重要因素。
可以通过调整这些条件来提高杂交效果。
此外，添加高浓度的盐类和保护剂可以提高杂交的特异性和效率。
原位杂交技术及其在肿瘤学中的应用
原位杂交技术及其在肿瘤学中的应用随着生物技术的不断进步和发展，人们对各种疾病的研究也越来越深入。
在肿瘤学领域中，原位杂交技术是一项重要的分子生物学技术，广泛应用于肿瘤的诊断、预后评估和治疗方案的制定等方面。
本文介绍原位杂交技术的原理、方法和在肿瘤学中的应用。
一、原位杂交技术的原理原位杂交技术是一种利用特定核酸探针标记的技术，能够在组织切片中定位和检测含有相应序列的核酸。
其中探针可以是DNA 或RNA，它们可以与被检测样本中互补的核酸序列结合，形成双链的杂交复合物。
在特定条件下，可以用放射性标记、荧光标记等物质标记探针，在显微镜下直接观察到杂交物的存在。
探针的标记能够直接观察，从而可以检测到被检测样本中特定核酸序列的分布情况和含量。
二、原位杂交技术的方法原位杂交技术主要有两类方法：放射性原位杂交（radioactive in situ hybridization，RISH）和非放射性原位杂交（non-radioactive in situ hybridization，NISH）。
RISH的探针使用放射性标记，可以通过显微放射自显影探测到探针的存在。
NISH使用非放射性标记，如荧光标记、酶标记等，可以通过显微镜下荧光显色、色素显色或发光检测等方法观察探针的存在。
原位杂交技术的步骤主要包括以下几个方面：（1）样品制备。
将组织样品固定在载玻片上，割成薄片，不同的组织要采用不同的制片方法。
（2）探针标记。
以目的核酸序列为模板，使用DNA或RNA 合成技术制备标记探针。
（3）杂交反应。
将标记探针加入组织切片上，结合后进行洗脱，使未结合的探针清除掉。
（4）染色。
对杂交反应结果进行染色处理，观察探针的标记情况。
三、原位杂交技术在肿瘤学中的应用原位杂交技术在肿瘤学中已经广泛应用。
例如，原位杂交技术可用于识别某些致癌基因的表达情况，以及在肿瘤细胞中表达特异性蛋白质的情况。
近年来，原位杂交技术也用于检测肿瘤标志物，例如乳腺癌的HER2/neu标志物、前列腺癌的PSA标志物、鳞状细胞癌的p16INK4标志物等。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
分子生物学研究中的原位杂交技术
分子生物学研究中的原位杂交技术1. 引言原位杂交技术(In Situ Hybridization，ISH)是一种分子生物学研究中常用的重要技术方法，它在研究基因功能、表达、定位和疾病等方面具有广泛的应用。
通过掌握ISH技术的基础知识和基本操作，可以为分子生物学的深入研究提供强有力的工具。
2. 背景知识ISH技术是通过将DNA或RNA探针与待检测物品（如细胞、组织、染色体等）发生靶向杂交反应，从而探究DNA和RNA序列在待检测物品内的分布、表达及功能等。
利用双链DNA分子中序列互补的特性，ISH技术可以检测同源性的DNA或RNA序列，并确定它们在待检测物品内的位置。
ISH技术有多种类型，其中包括原位DNA杂交（In Situ DNA Hybridization，ISDH）、细胞核流式原位杂交（Fluorescence InSitu Hybridization of Interphase Nuclei，FISH）、原位RNA杂交（In Situ RNA Hybridization，ISR）等。
FISH是目前应用最广泛的一种ISH技术，它能够在细胞核级别上进行检测，解决了ISDH只能检测染色体水平的限制。
3. 原位DNA杂交 (ISDH)ISDH技术是通过从待检测物品中提取DNA标记探针，利用其与待检测物品DNA发生互补杂交来实现。
它能够检测到DNA分子的位置和数量，并确定待检测物品中特定DNA序列的分布。
ISDH的操作步骤主要包括：（1）待检测物品的准备和固定；（2）DNA探针的制备和标记；（3）探针与待检测物品DNA的杂交；（4）洗涤和显色。
4. 细胞核流式原位杂交 (FISH)FISH技术是通过使用荧光探针，将荧光标记的DNA探针与待检测物品的染色体DNA或RNA发生互补杂交反应，直接在细胞核水平上检测DNA序列的位置和数量。
FISH技术不仅能够在正常染色体结构和分布的情况下对基因进行检测，还能够检测基因突变、重排等变异情况。
rna原位杂交技术
rna原位杂交技术RNA原位杂交技术（RNA in situ hybridization）是一种用于研究细胞和组织中特定RNA分子表达的重要实验方法。
它通过特异性杂交的原理，能够对细胞和组织中特定的mRNA或非编码RNA进行定位和可视化，从而揭示基因表达的时空分布情况，为研究基因功能和疾病发生机制提供了有力的工具。
RNA原位杂交技术的基本原理是利用互补的核酸序列进行杂交。
在实验中，首先需要制备一段具有特异性的标记RNA探针，该探针的序列与目标RNA的互补部分相匹配。
标记通常使用放射性同位素或荧光染料进行，以便在细胞或组织中可视化。
在进行RNA原位杂交实验时，首先需要固定样本，以保持细胞和组织的形态结构。
然后，通过脱水和透明化等处理，将样本与RNA 探针进行杂交。
杂交后，通过洗涤去除未结合的探针，然后进行探针的检测。
对于放射性标记的探针，可以使用放射自显影的方法进行可视化；对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察。
RNA原位杂交技术在生命科学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究胚胎发育过程中基因表达的时空分布，揭示基因在不同发育阶段和不同组织中的表达模式。
此外，RNA原位杂交技术还可以用于研究肿瘤的发生和发展机制，通过检测癌细胞中特定基因的表达情况，揭示肿瘤细胞的分化状态和侵袭能力。
近年来，随着高通量测序技术的发展，RNA测序已经成为研究基因表达的主流方法。
然而，与RNA测序相比，RNA原位杂交技术具有直接观察细胞和组织中RNA表达的优势。
它可以提供细胞和组织层面的信息，揭示基因在空间上的分布和相互作用。
因此，RNA 原位杂交技术与RNA测序技术相辅相成，共同推动了基因表达研究的深入发展。
尽管RNA原位杂交技术在研究中具有重要意义，但也存在一些局限性。
首先，由于RNA原位杂交实验需要杂交探针与目标RNA的互补配对，因此对探针的设计和合成具有一定的挑战性。
其次，在实验过程中，样本的固定和处理等步骤可能会对RNA的结构和表达产生一定的影响，因此需要进行严格的实验控制。
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原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。
1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
多种探针标记检测系统基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。
荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。
由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。
但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。
常用的报告分子如地高辛，生物素。
结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。
地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。
这是相较于生物素标记系统的优势。
地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。
但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。
通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。
原位杂交中探针的选择DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。
寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。
DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。
就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。
而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。
Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。
常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。
通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。
具体实验流程和注意事项可参考技术文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization原位杂交检测步骤原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1. 玻片的准备和样品固定对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。
对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。
样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。
对于染色体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。
冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2. 样品预处理在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。
如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。
如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。
在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。
通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。
根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。
染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。
也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3. 探针制备在进行研究前，确定应用的探针类型。
不同探针类型的优劣势请见上文描述。
DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。
RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。
寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。
但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4. 原位杂交过程杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。
预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖（见下）。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。
常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。
组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
杂交流程杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。
杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。
不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。
常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。
大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。
通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。
50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.01 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours杂交后的洗涤杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。
洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。
常规洗涤条件为含50%甲酰胺的2×SSC。
但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。
5. 免疫细胞化学反应(报告分子标记的探针)如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。
免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。
如进行生物素标记的探针杂交和检测，在含Tween 20 和BSA的PBS中进行封闭。
如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含Blocking Reagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。
如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 M NaCl 将有助于防止背景染色。
封闭后再进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C 30 min孵育(或室温2h孵育)。
抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5–10 min的洗涤。
酶反应显色：使用POD和底物DAB/咪唑构成的显色系统、AP和底物BCIP/NBT 构成的显色系统；酶免反应的检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好。
另外，AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/Fast Red TR, 用于提高荧光检测的灵敏度。