荧光原位杂交技术(FISH)常见问答
FISH——荧光原位杂交
FISH ——荧光原位杂交摘要：21三体综合征是怎样用FISH来诊断的？知识点：原位杂交菌落原位杂交荧光原位杂交( F luorescence I n S itu H ybridization, FISH)正常细胞异常细胞？21三体综合征的FISH产前诊断分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交原位杂交(in situ hybridization, ISH) 使探针进入细胞或组织内与待测核酸进行特异性结合形成杂交体从而对待测核酸进行细胞内定位1. 根据待测核酸序列信息设计合成带标记的特异性探针2. 制备待测样本(组织切片/细胞爬片)3. 经变性与复性探针与序列互补的待测靶核酸杂交4. 进行靶核酸的定位检测观察4. 进行靶核酸的定位检测观察 核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P 、3H 、35S 等2.非放射性标记：荧光素等 1. 放射性原位杂交2. 荧光原位杂交 ( F luorescence I n S itu H ybridization, FISH) 原位杂交的分类含有目的基因的阳性菌落菌落原位杂交4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交 ( F luorescence I nS itu H ybridization, FISH)采用荧光素标记的探针与待测样本中的靶核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，达到对染色体或基因异常的细胞或组织标本进行检测诊断4. 进行靶核酸的定位检测观察21三体综合征的FISH产前诊断21号待检染色体的特异探针(红色) 和13号对照染色体的特异探针(绿色)与羊水间期细胞进行荧光原位杂交FISH20号染色体着丝粒探针(红色) 和20号染色体基因座特异性探针(绿色)20号染色体微缺失的FISH 检验荧光原位杂交检测染色体易位染色体核型分析检测染色体易位4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交的临床应用先天性疾病检验唐氏综合征肿瘤疾病检验慢性粒细胞白血病感染性疾病检验HPV、HBV4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交的临床应用常规诊断标本：全血、骨髓细胞、口腔细胞、精细胞、子宫颈细胞等产前诊断标本：羊水细胞、绒毛细胞等4. 进行靶核酸的定位检测观察FISH ——荧光原位杂交 安全无污染 快速 直观 特异。
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。
1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。
20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。
随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。
相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。
这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。
FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。
FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。
（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。
其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。
什么是荧光原位杂交（FISH）？
什么是荧光原位杂交（FISH）？“关于FISH实验的一些内容。
”近来，有伙伴在后台咨询了荧光原位杂交(FISH)实验的相关知识，因此小编想在今天推文简单聊一聊FISH实验，也讲点新花样。
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小编也会考虑将相关内容整理，以推文形式发出来。
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01—什么是FISHFISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。
上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。
在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。
有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA 的表达了。
FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。
这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。
02—FISH的实验要点网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。
懂了原理，才能以不变应万变。
因此，本部分主要是详细讨论实验要点。
FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
要点：（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。
刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。
（2）蛋白酶K的作用浓度。
浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。
FISH技术全攻略
FISH（荧光原位杂交）技术全攻略荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。
该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。
该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。
1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。
2 如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH 的杂交效果。
3 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。
FISH荧光原位杂交
(1) 玻片预处理玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，清水浸泡过夜；1%的盐酸浸泡24小时，蒸馏水清洗干净后置0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）中浸泡过夜。
硅化处理：将载玻片和盖玻片用1%的盐酸煮沸10min后，用0.1%DEPC处理的蒸馏水冲洗，60℃烘干。
盖玻片用锡纸包好4℃保存备用。
黏附剂涂片制备：载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液中约1min，取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，然后置4℃保存备用。
(2) 样品采集和预处理取样：用经高压灭菌的聚乙烯管子取湿地基质并称量，加灭菌蒸馏水适量振荡混匀，超声波处理使细菌分散。
取清洗下来的悬浊液约1ml进行后续处理。
样品固定与清洗：悬浊液中按1:1加入4%多聚甲醛于4℃固定24小时；将固定样本用磷酸缓冲液(PBS)10000r/min离心漂洗二次，弃去上清液。
用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20℃保存备用。
热固定与脱水：取10μl样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小，37℃的烘箱热固定2h 后依次用50%，80%，96%乙醇室温下脱水3min，室温干燥。
(3) 杂交反应硝酸菌的探针见表4.2：杂交液配置：总细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌杂交液中去离子甲酰胺（DAF）浓度分别为20%、40%或55%去离子甲酰胺（DAF），其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl（pH8.0）20mmol/L，NaCl 900mmol/L。
表5-1硝酸菌与亚硝化细菌探针序列Tab. 5-1 Probe and sequences of nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and total bacteria 细菌探针名称探针序列（5’—3’）5’—标记总细菌EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT HEM硝酸细菌NIT3 CCT GTG CTC CA T GCT CCG FITCCNIT3* CCT GTG CTC CAG GCT CCG亚硝酸细菌NSO190 CGA TCC CCT GCT TTT CTCC HEXCNIT3* 为硝酸菌探针NIT3的竞争探针探针浓度均为50ng/μl。
免疫荧光原位杂交技术
免疫荧光原位杂交技术免疫荧光原位杂交（immunofluorescence in situhybridization，简称FISH）技术是一种目前被广泛应用于细胞和组织中的分子生物学技术。
它的应用范围涵盖了人类健康、疾病诊断、基因表达和细胞遗传等诸多领域。
本文将介绍FISH技术的原理、操作步骤及其在各个领域的应用，希望能对你有所启发。
首先，我们来了解一下FISH技术的基本原理。
FISH技术结合了免疫荧光和原位杂交两种方法，可以同时检测细胞或组织中的特定DNA序列与特定蛋白质的共定位。
通过标记特定的DNA探针和特定的抗体，可以在细胞或组织中检测到目标分子的位置和表达水平。
使用FISH技术的步骤如下：首先，应选择合适的标记方法和荧光探针。
标记方法常用的有直接标记和间接标记两种。
接着，将标记过的DNA探针与样本（细胞或组织）接触，使其与目标DNA序列杂交。
经过洗涤、固定和照相，可以观察到目标DNA序列的位置及其与蛋白质的共定位情况。
FISH技术在各个领域都有广泛应用。
在人类健康方面，FISH技术可用于遗传疾病的诊断、肿瘤基因分析和染色体异常的检测。
通过检测染色体畸变和基因突变，可以帮助医生准确判断疾病的种类和程度，为疾病的预防和治疗提供指导。
在基因表达研究中，FISH技术可用于检测特定基因的表达水平、研究基因组中的微小区域以及非编码RNA的研究。
通过观察目标基因在细胞中的表达情况，可以深入了解基因在生理和病理过程中的功能及其调控机制。
此外，在细胞遗传学中，FISH技术可用于研究染色体结构、染色体的分离和重组事件的发生机制。
通过观察染色体在细胞分裂过程中的运动轨迹，可以揭示染色体复制、分离和重组等关键生物学过程的机制。
综上所述，免疫荧光原位杂交技术是一种生物学研究中重要的分子生物学技术。
它可以帮助我们更全面地了解细胞和组织中的分子表达及其调控机制。
未来，随着技术的不断发展和创新，FISH技术将在医学诊断、基础科学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。
荧光原位杂交技术操作的常见问题分析
荧光原位杂交技术操作的常见问题分析江冬瑞;王弦;吴强【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(031)012【总页数】2页(P1426-1427)【关键词】荧光原位杂交;免疫组织化学;临床病理;诊断【作者】江冬瑞;王弦;吴强【作者单位】安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥230032;安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥230032;安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥230032【正文语种】中文【中图分类】R446江冬瑞，王弦，吴强目前，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)因具有灵敏度高、特异性强、定位明确及结果客观等优点［1］，在临床上已应用于产前染色体数目检测、肿瘤基因检测，如多发性骨髓瘤检测和慢性淋巴细胞性白血病等的检测，担负着辅助病理诊断和指导临床用药的重任。
日常病理诊断中，应用FISH技术检测乳腺癌HER-2和TOP2A基因扩增，可以判断预后，指导靶向治疗和辅助化疗;在非小细胞肺癌中检测EGFR基因突变，可以筛选靶向治疗的适用人群;检测TERC基因用来进行子宫颈病变临床分级和预测子宫颈癌的进展［2］;另外在淋巴瘤和前列腺癌等方面，还有一些探针可以用于辅助诊断。
虽然FISH检测技术具有安全、试验周期短、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点［3］，被临床病理工作者广泛认可，但该技术操作相对复杂，检测价格昂贵，目前各实验室的条件不一，FISH检测技术的标准化和质量控制就显得格外重要。
安徽医科大学第二附属医院病理科经过反复实验摸索，于2010年4月建立FISH技术平台以来，现已成功开展HER-2 FISH检测180例，在此将操作注意事项及常见问题作一小结，以便与大家一同交流。
建立FISH技术平台，除需要一间可以进行荧光实验操作和显微观察暗室外，还需要原位杂交仪、荧光显微镜、显微镜滤光片、水浴箱、漩涡混合器、普通离心机、移液器、FISH探针试剂盒、无水乙醇、二甲苯、去离子水、橡胶水泥、透明指甲油等设备和试剂。
免疫荧光原位杂交技术FISH
变性杂交
结果统计
羊水标本玻片的制备
离心 胰酶消化 低渗（0.075M KCL） 预固定、固定 滴片（控制好悬液浓度、量、高度）
胰蛋白酶（Trypsin）消化
操作中要控制好酶的工作浓度,适量加大酶 有助于加强消化作用,但盲目加大酶量超过 酶饱和度不一定起到加强消化的作用。实 验中应控制好酶的工作浓度,不同批次、不 同储存时间及温度影响酶消化强度及饱和 度。
37º C 蛋白酶k 5-30min
洗片
DAPI染色
阅片
脱蜡
石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟 浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水 各2分钟 浸入去离子水3分钟
(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)
预处理
I. 100 º C沸水处理组织切片30分钟 II. 100ug/mL的蛋白酶K溶液,37 º C孵育5-30 分钟
HER-2基因扩增模式
肺癌细胞观察计数及结果分析
100X油镜下癌区随机计数100个细胞，计 算红绿信号的比值（Ratio） 扩增：I: Ratio>2 II:15copy>或=10% III:成簇扩增 IV： Ratio<2但4copy>或=40% 阴性：除以上扩增的情况
EGFR基因扩增检测试剂盒 （FISH）
低渗处理和固定
细胞置于KCL低渗溶液中吸收水分可使细胞 胀破，使探针更容易与核内DNA杂交结合 ，便于结果分析。
固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形 成核蛋白交联定型。提高细胞核与载玻片 的亲和力，使探针DNA易于进入细胞。
预处理
• • • • • • 37 º PBS 5min C 37 º 0.005%胃酶15min C 1xPBS 3min 1%多聚甲醛10min 1xPBS 3min 2次 梯度脱水
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荧光原位杂交技术（FISH）常见问答对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。
在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。
此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。
因此保证FISH操作中的温度非常重要。
该如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH 操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。
使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。
但随后信号急剧衰减。
几分钟后信号就消失了。
这是探针本身的质量问题吗？在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。
出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。
阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。
因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。
也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。
如何配制各种试剂呢？强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。
此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。
配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。
每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。
洗脱液和变性液当天用当天配。
直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。
与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。
随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。
因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。
我能对同一样本进行多次的FISH操作吗？在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。
如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。
针对不同的样本，处理方法略有不同。
外周血样本的处理：1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。
将片子风干后就可以进行重复的杂交了。
二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。
如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。
曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。
也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。
将片子风干后就可以进行重复的杂交了。
二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。
如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
H&E 去染色由于H&E染色使样本片在荧光显微镜下出现类似自发的荧光，因此有必要洗去H&E染色。
以下的步骤并不能洗去100％的H&E，但对于大多数的H&E样本片，建议进行以下操作。
1、揭去盖玻片，置于65ºC的预处理液中孵育45分钟。
残余的可见染料可在随后的去石蜡操作中被除去2、进行标准的去石蜡预处理操作当将0.1% NP-40的洗液加热时出现混浊，是否正常？加热时洗液出现混浊是正常的，并不会干扰FISH的结果。
复合荧光原位杂交和光谱核型分析进展徐岚陈赛娟用染色体核型分析进行细胞遗传学检查，因其实用性和准确性，很快成为染色体异常的常规筛选检查。
但是由于核型分析并不能完全适应复杂核型分析的需要，特别对于一些实体瘤组织，不仅染色体改变复杂，而且难以制备有一定质量的中期染色体分裂相，因此，更难以用传统核型分析得到准确结果。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)由于其高度敏感性和特异性，已成为另一有力的细胞遗传学研究工具，并与核型分析互相补充联合应用［1］。
在此基础上，随着探针制备的完善与发展，进一步衍生出染色体涂抹(chromosome painting,CP)［2］，比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)［3］及反向染色体涂抹(reverse CP,RCP)等［4］。
这些技术的联合应用，丰富了细胞遗传学研究内容，使细胞遗传学向分子领域发展，并在临床和科研工作中得到广泛应用。
但是FISH也有其局限性，首先它只能用特异性的探针检测已知的染色体异常；其次，能够同时检测的目标数受限于探针数，也就是荧光显微镜所能分辨的荧光素的数目［5］。
因此，FISH不能作为染色体异常的筛选实验。
1990年，Nederlof等［6］描述了一种方法，仅用3种荧光素标记了7种探针(表1)，这种方法称为联合标记(combinatorial labeling)。
1992年，David Ward等［7］再次用3种荧光素同时检测了7个DNA探针，证实了其可行性。
于是，科学家们设想给人类22条常染色体和2条性染色体染上不同的颜色，可以在一份标本上同时看到24种颜色显示出所有染色体。
但是由于技术与设备等原因，直到1996年Speicher等［8］在一次对分裂中期染色体的分析中，同时以24种颜色显示出所有染色体。
这种细胞遗传学方法被称为复合FISH(multiplex FISH,mFISH)。
表1 mFISH联合标记方法1 mFISH基本原理和方法将一个人类染色体探针池分别标记上24种不同的荧光素组合，然后与中期染色体分裂相进行杂交，经电荷耦联装置(charge-coupled device,CCD)显微镜摄像，计算机处理产生24色人类染色体图像。
mFISH的成功依赖于24色探针标记，滤片装置的选择及计算机软件的发展［5］。
1.1 探针标记和荧光选择mFISH的DNA探针是由显微切割产生、并经PCR扩增的全染色体探针［9］，经缺口平移法进行联合标记。
联合标记的出现，使N个荧光素可标记远远多于该数目的探针。
如，2种荧光素可标记3种探针，3种荧光素可标记7种探针，那么N种荧光素可组成的有效组合是2N-1，5种荧光素即能产生31种组合，已满足了检测24种染色体的需要。
这5种荧光素包括：异氰酸荧光素(FITC)、花氰染色(Cy)3、Cy3.5、Cy5和Cy7，同时用于标记24种染色体(表2)。
在联合标记中，一条染色体或者100%用某种荧光素标记，或者没有用这种荧光素标记。
而在另一种新的标记技术——比例标记(ratio labeling)中［10］，通过变换荧光素比例(0～100%)达到标记的目的。
如仅使用2种荧光素FITC和德克萨斯红(Texas red)能标记5条染色体，显示出5种颜色(表3)。
与联合标记相比，比例标记可以用更少的荧光素得到更多的组合，标记更多的探针，联合标记与比例标记的共同使用，将进一步完善mFISH标记技术［11］，获得更广的应用范围。
1.2 滤片选择滤片选择每个荧光素与其波长最接近的2个荧光素的激发/发散比值比＞90%［5，8］。
如，Cy5与Cy5.5的激发/发散比值比为80%～90%，而其他荧光素的比值比均大于90%，因此，Cy5.5不适用于mFISH。
此外，滤片的带宽被限制在5～15 nm范围内，而其他标准滤片的带宽约为50 nm或更宽［8］。
1.3 电脑图像处理mFISH的图像处理是另一关键步骤。
mFISH图像处理软件系统首先纠正由干扰产生的几何图像的移位；根据4，6-二脒-2-苯吲哚(4，6-diamino-2-phenyliodole dihydrochloride,DAPI)染色分辨出一个中期分裂相中所有染色体；计算每种荧光的背景强度阈值；建立每个探针的光谱信号，然后通过识别与探针杂交物质来鉴定染色体，产生复合的灰值图像，每对染色体分别由1种灰值编码，最后给每种灰值一种伪彩色，并显示出结果［12］。
表2 5种荧光素联合标记人类24条染色体表3 mFISH按比例标记方法简而言之，Speicher的方法是通过转换滤片来捕获每个荧光素的单独图像，然后用CCD摄象系统和电脑处理软件叠加每条染色体上的荧光，产生至少24种的伪彩色。
同年，Schrock［13］用另一种技术——光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)同样进行了24种彩色染色体的分析。
两者相比，基于滤片摄取原理的mFISH允许使用更广范围的荧光素，产生更少的原始数据，更易进行结果处理。
2 应用2.1 染色体核型分析常规染色体核型分析不仅需要高强度劳动力，而且还依赖于个人技术，不能进行完全自动化分析［5］。
常规FISH也有其限制性，而mFISH 能有效弥补两者的缺陷。
与FISH相比，mFISH能在一次杂交实验中筛查所有染色体，并不需要预先知道其核型异常。
由于它是通过多次杂交实验找到每条染色体探针的最佳荧光位置，一旦探针构成参数建立了，那么每次杂交的变异就很小，因此可以获得高度的重复性［12］。
mFISH能对中期染色体分裂相进行快速分析，即使有很复杂的大量染色体的重排，也能很快分析出；特别对一些未知来源的标记染色体，能很快根据颜色确定其来源；mFISH更能提供全自动核型分析［15］，既克服了常规核型分析的缺点，又具有部分FISH的优点，有其独特的应用价值。
mFISH用于染色体核型分析，可以鉴定数目异常，一些结构重排，例如简单和复杂结构易位，比较大的重复和缺失及一些臂间倒位也能简单鉴定出，重要的是mFISH相对于核型分析来说是全自动，节省了劳力与时间［15］。