荧光原位杂交(FISH)和用引物介导的原位标记(PRINS)sop
荧光原位杂交(FISH)检测
荧光原位杂交（FISH） 荧光原位杂交（FISH）检测
康圣环球医学特检集团
临床意义 从遗传学角度检测染色体和基因的异常 辅助血液疾病的诊断，判断预后，疗效检测及
微小残留检测
应用： 骨髓移植术后（性别不同的移植献者）、 性别鉴 定、CMPD和ALL初诊、CML末次化 疗结束两 周以上、AML-M3/M2等疾病
Байду номын сангаас 技术特点 可分析间期细胞，不需培养；操作简单、检测快速 重复性好、空间定位精确；灵敏性和特异性高 当染色体核型分析不成功或不明确时，可利用FISH 检测弥补不足，并可发现复杂易位
报告时间：周一至周五，7个工作日
报告示例：略 结果判读：每个探针检测镜下分析200个细胞核。 20例没有造血系统疾病且核型正常的骨髓标本作为 正常对照，以此计算分裂信号的平均数和标准差。 如果有异常杂交信号的细胞百分比超过正常标准差 的3倍，结果将被认为异常。
探针种类 双色单融合探针 ES探针 双色分离探针 双色双融合探针
每类探针的检测和适用范围不同，决定其用处不同
标本要求 送检标本：骨髓3ml（CML和CLL患者可直接用外周 血2ml） 保存条件：肝素钠抗凝，4摄氏度，24h送检 禁忌：冰冻或凝块 注意：建议做FISH的同时做常规细胞遗传学分析。若 只要求做FISH，请转交一份近期的细胞遗传学报告 。如果无细胞形态学或遗传学的检查，建议作进一 步检查！！
概述 FISH原理是采用荧 FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用荧 光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中DNA DNA探针 DNA碱基 光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中DNA碱基 对的互补性，在探针与标本的DNA杂交后， DNA杂交后 对的互补性，在探针与标本的DNA杂交后，通过荧光 显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、 显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、 组织样本中的染色体和基因异常。 组织样本中的染色体和基因异常。
荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用
荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用
荧光原位杂交（FISH）在肠道微生物学中的应用
一、荧光原位杂交概念
荧光原位杂交（FISH），是一种克服转录-聚合酶链反应（PCR）技术的空白，检测和定位特定部位的具体特异性的 DNA 片段的一种受控的基因扩增技术。
它具有快速、准确、实时的特点，使得它可以被用来研究微生物遗传信息以及追踪微生物感染源。
二、荧光原位杂交在肠道微生物学中得用
FISH技术通常用于识别某些特定微生物物种和检测微生物数量，从而更好地了解肠道微生物群落结构、活性和功能。
1、研究肠道微生物群落结构
FISH技术可用于在原位条件下识别和定性细菌和其他微生物，为肠道微生物群落结构的定性和定量研究提供可靠的数据。
例如通过测定不同种类的肠道细菌的相对丰度情况，FISH技术能够分析肠道细菌群落中多种微生物的形态、组成和统计结构。
2、检测微生物感染源
FISH技术能有效检测和排除肠道疾病的病原体，使获得更清晰的诊断结果，从而在确定治疗对策中发挥重要作用。
此外，它也可用于检测微生物的抗药性，以及检测重要病原微生物的致病基因表达情况。
3、用于分析肠道微生物活性
FISH技术还能用于分析肠道微生物的活性，如酶活性和代谢产物的相对��度，和肠道微生物群落复合碳源代谢（Cometabolism）潜力等。
这些信息有助于研究肠道微生物的作用以及促进人类营养和健康。
三、总结
FISH 技术在肠道微生物学中具有重要的应用，可用于研究肠道微生物群落结构和活性，检测微生物感染源以及抗药性，分析肠道微生物的代谢和功能，以及提高其营养和健康的效果。
它将可能为临床诊断提供及时有效的方法。
荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
什么是荧光原位杂交（FISH）？
什么是荧光原位杂交（FISH）？“关于FISH实验的一些内容。
”近来，有伙伴在后台咨询了荧光原位杂交(FISH)实验的相关知识，因此小编想在今天推文简单聊一聊FISH实验，也讲点新花样。
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01—什么是FISHFISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。
上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。
在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。
有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA 的表达了。
FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。
这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。
02—FISH的实验要点网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。
懂了原理，才能以不变应万变。
因此，本部分主要是详细讨论实验要点。
FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
要点：（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。
刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。
（2）蛋白酶K的作用浓度。
浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。
免疫组化及PCR操作流程
细胞免疫组化步骤1. PBS冲洗两次2. 丙酮固定10min3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min4. PBS振洗2次,每次3min5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min6. 弃去血清7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释)8. PBS振洗3次,每次3min9. 加二抗, 37℃30 min10. PBS振洗3次,每次3min11. 加ABC复合剂, 37℃30 min12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min14. 自来水洗5min15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min17. 透明，过二甲苯3次，每次1min18. 封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
fish-荧光原位杂交
五、杂交后洗涤
1.从杂交盒中取出片子，用镊子轻轻拉掉密封胶。
2.将片子放入预热过的杂交后缓冲洗液 （2XSSC/0.3%NP-40）中，漂洗掉盖玻片。 3.盖玻片小心被去掉后，吸干载玻片边缘过多液体， 把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72±1℃2min。 4.从杂交后缓冲液中移出载玻片，把载玻片放在暗 处竖立空气中干燥。
六、衬染及封片
1.加10uL DAPI复染载玻片靶区并加盖盖 玻片。
2.荧光显微镜观察或在暗处-20oC保存。
荧光显微镜观察FISH结果
FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在
的位置，以HER-2 DNA Probe来说，它会把 HER-2基因部位橘红色荧光亮点，还将第17 对染色体的中心颗粒（centromere）呈现绿 色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的 数目，若橘色点/绿色点大于2，就表示有 HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目 比值小于2。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸
为探针，按照碱基互补的原则，与待检材 料中未知的单链核酸进行特异性结合，形 成可被检测的杂交双链核酸。
探针
染色体特异重复序列探针；
如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重
复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测。
全染色体或染色体区域特异性探针；
Hale Waihona Puke 1+2+
3+
正常
Her2基因低度表达
Her2基因高度表达
三、探针准备
1.室温下让探针复温，降低探针的黏度，以便 探针充分准确吸取。 2.涡流混合。把内容物装入试管底部，每个试 管用台式离心机离心2-3秒，然后再次轻 轻涡流混合。
FISH杂交技术
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荧光原位杂交特点
1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高； 2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安
全； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性
探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测
于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗
传学研究。
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FISH发展
¡ 20世纪90年代， 随着人类基因组计划 的进行，由于绘制高 分辨人类基因组图谱 的需要，FISH技术得 到了迅速的发展和广 泛应用。
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FISH原理
FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子 为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交 ，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和 离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交 体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过 荧光显微镜观察杂交信号。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进 行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧 光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用
.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FISH发展
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模 板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期 染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的 同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标 记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的 限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交 技术不能很快得到广泛应用。
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名称：荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程
关键词：荧光原位杂交、引物介导的原位标记
目的：熟悉荧光原位杂交和用引物介导的原位标记的实验方法
背景知识：选填项目
原理：选填项目
主体内容：
仪器设备
1、医用微波炉；
2、水浴锅；
3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；
4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂
（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
（2）20×SSC（pH7.0）；
（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤
1、脱蜡：
1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2）100％酒精两次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：
1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5）空气干燥。
4、杂交：
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。
把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：
12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。
切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
PRINS步骤
1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃15min；
4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；
5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；
6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
8、片于65℃10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；
9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；
13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。