荧光原位杂交(FISH)范文
荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
荧光原位杂交实验流程英文
荧光原位杂交实验流程英文Alright, here's a casual and conversational description of the Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) experiment process in English:First up, let's start with preparing the slides. You'll need to fix the cells on the slides and make sure they're ready for hybridization. Think of it like setting the stage for a big show!Once the slides are ready, it's time to denature the DNA. This is a bit like unlocking the secrets within the cells' nuclei. You'll use chemicals to loosen up the DNA strands, making them accessible for the next step.Now, let's get to the hybridization part. This is where you add the fluorescent probes that will bind to specific sequences in the DNA. Imagine these probes as keys that fit into specific locks on the DNA strands.After hybridization, you'll need to wash off any unbound probes. This step is crucial to make sure you only see the signal from the probes that have actually bound to the target DNA. Think of it as clearing away the distractions.And finally, we get to the exciting part visualization! You'll use a microscope to see the fluorescent signals.It's like exploring a galaxy of colors within the cells. Each color represents a different sequence, allowing you to map out the genome in a whole new way.So there you have it, a casual walkthrough of the FISH experiment process.。
组织细胞荧光原位杂交检查
组织细胞荧光原位杂交检查组织细胞荧光原位杂交检查：新时代肿瘤诊疗的重要手段组织细胞荧光原位杂交检查（FISH）是一种现代肿瘤检测手段，已被广泛应用于癌症诊断、预后评估和治疗选择等方面。
本文将从技术原理、临床应用和未来发展三个方面进行介绍。
技术原理FISH技术首先需要获得肿瘤组织标本，并进行脱水、固定和切片等预处理。
随后，通过特定的探针标记DNA部位，FISH技术可以准确地检测染色体异常、基因拷贝数变异和染色体重排等基因结构异常。
同时，FISH技术能够利用荧光标记的探针直接定位到细胞核内某个部位，提高了细胞水平的检测精度。
临床应用FISH技术在临床上主要用于癌症检测和治疗决策。
例如，FISH技术可以检测HER2基因的扩增情况，预测HER2阳性乳腺癌患者对赫赛汀治疗的敏感性和疗效。
此外，FISH技术还可以检测多种癌症患者的病理类型、亚型和分级等信息，有助于个体化治疗的制定和预后评估的精准性提高。
FISH技术还可以应用于遗传学疾病的诊断和预测等方面。
未来发展随着生物技术的迅猛发展，FISH技术的应用范围将更加广泛。
例如，利用荧光标记的超高分辨率探针，可以实现单基因级别的检测。
此外，结合缺损补偿系统、多肽分子探针等新技术，FISH技术将更加高效、快速、精确地检测细胞内的基因变化和功能异常。
同时，在分子分型、免疫分析、仿生工程等多领域的应用下，FISH技术的潜力已经远远超出了当前的肿瘤诊疗范畴。
总之，FISH技术作为一种现代肿瘤检测手段，具有高度的准确性、灵敏度和特异性，为癌症诊断和治疗决策提供了重要依据。
随着技术的不断创新和应用范围的扩展，FISH技术的发展将为肿瘤诊疗带来新的突破和希望。
（注：本文700字）。
浅谈荧光原位杂交技术(fish)在诊断精子多倍体中的应用研究进展
浅谈荧光原位杂交技术（FISH）在诊断精子多倍体中的应用研究进展浅谈荧光原位杂交技术（FISH）在诊断精子多倍体中的应用研究进展摘要：近年来，由于FISH 技术具有安全、快速及灵敏度高的特点，在诊断精子多倍体中得到了广泛应用，本文主要对荧光原位杂交技术（FISH）在诊断精子多倍体中的应用研究进展进行综述。
关键词：FISH技术精子多倍体1、荧光原位杂交（FISH）技术的概念及原理荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，FISH的基本原理是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。
2、异种体外受精技术的限制精子染色体检测方法主要有异种体外受精技术（人精子?仓鼠卵融合技术）制备人精子染色体和精子FISH分析[1，2]。
1978年Rudak[3]等采用异种体外授精技术首次制备出人精子染色体标本，此方法可以直接观察到精子全部染色体组成，精确分析染色体结构、数目。
但是由于这一技术需要模拟体内精卵结合，以及需要保证体外精子获能的条件和仓鼠的超排卵数等，技术难度大、实验条件要求高，制片成功率低，因此限制了此技术的广泛应用。
3、 FISH技术检测非整倍体的优点非整倍体是导致人类胚胎丢失和染色体疾病的主要原因之一，而非整倍体的产生是由于生殖细胞减数分裂过程中的染色体不分离造成的，因此，阐明非整倍体产生的机制具有重要的意义。
目前，国内外大部分的研究者都通过收集一定数量质量异常与正常的精液标本，通过应用XY性染色体重复序列探针，对处理后的精子细胞进行荧光原位杂交分析，探讨FISH技术在诊断精子多倍体中的应用，从而建立各自实验室精子FISH分析的技术平台，这种方法有助于患者的遗传咨询、PGD异常胚胎的风险预测及携带者有无PGD必要性的评估。
免疫荧光原位杂交技术
免疫荧光原位杂交技术免疫荧光原位杂交（immunofluorescence in situhybridization，简称FISH）技术是一种目前被广泛应用于细胞和组织中的分子生物学技术。
它的应用范围涵盖了人类健康、疾病诊断、基因表达和细胞遗传等诸多领域。
本文将介绍FISH技术的原理、操作步骤及其在各个领域的应用，希望能对你有所启发。
首先，我们来了解一下FISH技术的基本原理。
FISH技术结合了免疫荧光和原位杂交两种方法，可以同时检测细胞或组织中的特定DNA序列与特定蛋白质的共定位。
通过标记特定的DNA探针和特定的抗体，可以在细胞或组织中检测到目标分子的位置和表达水平。
使用FISH技术的步骤如下：首先，应选择合适的标记方法和荧光探针。
标记方法常用的有直接标记和间接标记两种。
接着，将标记过的DNA探针与样本（细胞或组织）接触，使其与目标DNA序列杂交。
经过洗涤、固定和照相，可以观察到目标DNA序列的位置及其与蛋白质的共定位情况。
FISH技术在各个领域都有广泛应用。
在人类健康方面，FISH技术可用于遗传疾病的诊断、肿瘤基因分析和染色体异常的检测。
通过检测染色体畸变和基因突变，可以帮助医生准确判断疾病的种类和程度，为疾病的预防和治疗提供指导。
在基因表达研究中，FISH技术可用于检测特定基因的表达水平、研究基因组中的微小区域以及非编码RNA的研究。
通过观察目标基因在细胞中的表达情况，可以深入了解基因在生理和病理过程中的功能及其调控机制。
此外，在细胞遗传学中，FISH技术可用于研究染色体结构、染色体的分离和重组事件的发生机制。
通过观察染色体在细胞分裂过程中的运动轨迹，可以揭示染色体复制、分离和重组等关键生物学过程的机制。
综上所述，免疫荧光原位杂交技术是一种生物学研究中重要的分子生物学技术。
它可以帮助我们更全面地了解细胞和组织中的分子表达及其调控机制。
未来，随着技术的不断发展和创新，FISH技术将在医学诊断、基础科学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。
荧光原位杂交(FISH)范文
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）1.实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
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FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）1.实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
3. 实验用具及材料Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。
4. 实验方法及步骤1）探针及标本的变性（1）探针变性将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
（2）标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。
（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。
2）杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～17h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
3）洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
（3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
（4）在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。
4）杂交信号的放大（1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
（2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
（4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。
（5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。
（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5）封片可采用不同类型的封片液。
如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。
封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
6）荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。
细胞被PI 染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。
由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。
照相记录实验结果（图16-1）附录I FISH相关溶液的配制1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0）。
2）去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。
电磁搅拌30min，用Whatmanl 号滤纸过滤。
3）体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。
4）体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。
5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6）杂交液：8mL体积分数25%DS，20mL 20×SSC混合。
（或40mL体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。
其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF。
7）PI/antifade溶液PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5mg /mL。
Antifade 原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。
取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，-20℃保存备用。
8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。
9）封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。
10）封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL 混合。
11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。
12）洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。
13）TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。
14）溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。
15）溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。
16）溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。
17）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH调pH值至7.0。
附录II DNA探针的制备质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定。
1）用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌，接种于5mL LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜。
2）将收集到的菌液3000r/min离心10min，弃掉上清液。
3）向菌体沉淀中加入溶液I300mL, 溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为1：1）500mL 后充分混匀。
4）12000r/min离心10min。
5）取上清液，向其加入600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min离心15～30min，弃掉上清液。
6）用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。
7）用TE缓冲液溶解DNA沉淀。
8）加水至200mL，以Rnase A（终浓度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。
9）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比25：24：1）溶液200mL混匀，12000r/min离心2min。
10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为24：1）200mL混匀，12000r/min离心2min。
11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。
12）可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min离心15min。
13）将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。
14）用TE缓冲液溶解DNA。
15）取1～2mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度。
16）取1mg DNA，用相应限制性内切酶4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。
17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。
附录III 探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。
该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。