二 双水相萃取

P为聚合物 Q为盐类
聚乙二醇
磷酸钾、硫酸铵、硫 酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
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双水相体系也可分为：高聚物／高聚物体系和 高聚物／低分子物质体系。 在高聚物／低分子物质体系中，PEG／盐体系是 最常见的价廉体系。 在高聚物／高聚物体系中，蛋白质和细胞在两 相中的分配取决于高聚物分子量、浓度、pH值及 盐浓度等因素，这种体系可直接用离子交换层析 进一步纯化，且可回收高聚物，使成本降低。 高聚物／高聚物体系成本比PEG／盐体系的高出 3~5倍，但不会造成严重的环境污染，并易于生物 降解。
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密度差是一个与过程操作和设计有关的重要因素。 靠近临界点的相对密度差较小，因此相的 分离速度较慢； 远离临界点的聚合物浓度高，聚合物富相 的粘度会增加也会导致低的分离速度，所以 在中间组成时，分离速度最佳； 含水量较高时，两相的密度会趋向一致， 密度在1000~1100kg／m3之间。
系线反映的信息
VB AM VA MB
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结线关系到相的平衡组成。所有组成在系线上 的点，分成两相后，其上下相组成均分别为B和A， 其体积比(VB／VA)不同。 相体积比与线段比(MB／MA)可从聚合物的质量平 衡得到：
m0 mB m A
mB VB B C B
VA A CB CO mB VB B CO C A mA
K BZ
1.42 1.21 1.12 0.92
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三 、疏水作用
相间疏水因子(HF, hydrophobic factor) PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏 水性差用HF表示. HF可通过测定疏水性已知的蛋白质在其 pI处的maa测算:
RH-aa相对疏水性(relative hydrophobicity).是通过 测定蛋白质在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性 最小的Gly的RH=0.所以,上式中的B为:
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3)、pH value
A
lnm
(pH – pI) value pro(Z)
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B 交 错 分 配 法 (cross partitioning): 当加入不同种类的盐时，由于相 间电位不同，lnm–pH关系曲线也 不 一 样 。 但 在 pro 的 pI 处 ， 由 于 Z=0，m应相同，即两条关系曲线 交于一点。所以, 通过测定不同盐 类存在下 lnm–pH曲线的交点,可 测定蛋白质\细胞器以及微粒的pI。 C pH 影 响 磷 酸 盐 解 离 ： 即 影 响 PEG/Kpi系统的相间电位和蛋白 质的分配系数。对某些pro, pH的 很小变化会使m改变2~3个数量级。
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(1)相图 双水相系统聚乙 二醇(PEG)6000—葡聚糖— 水系统(4℃). a.双节线(bi-nodal) ASB,线 下这两种聚合物都能与水无 限混合，曲线的上方 (用M 点表示)体系就会分成两相， 组成和密度不同，轻相(上 相)组成A点，重相(下相)组 成B点，A、B点→结点。上 相主要含PEG；下相主要含 葡聚糖。 b. 直 线 AMB→ 系 线 (tie line) 。
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二、表面电荷的影响 道南电位（Donnan Potential）当带有电 荷在两相中分配不相等时（即分配系数不为 1.0），就会在两相之间产生电位差，称为道 南电位
Z RT KB U 2 U1 ln Z (Z Z ) F K A
ln K
* i
Z iFΨ ln K i RT
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有机溶剂萃取的不足： 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
双水相萃取的优点(一)
① 使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成； ② 适合热敏物质的提取，主要是胞内酶； ③ 亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中， 水分都占大比例（85～95％），这样生物活性蛋白 质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。
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双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction) • 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一 种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合 物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓 度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。 • 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋 白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同 比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中 蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
第二节 双水相萃取 (Two—aqueous phases extraction)
基因工程产品（蛋白质和酶）往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取和纯化:
细胞颗粒尺寸的变化给固—液分离带来困难;
产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环
境因素特别敏感;
由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性;
三、混溶性和相平衡
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A) 杠杆规则：系线上各点均为分 成组成相同，而体积不同的两 相。两相体积近似服从杠杆规 则； B) 性质差异：系线的长度是衡量 两相间相对差别的尺度,系线 越长,两相间的性质（密度） 差别越大；反之则越小；
C) 临 界 点 (critical point)： 当系 线长度趋于零时, 两相差别消 失,任何溶质在两相中的分配 系数均为1。如S点。
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双水相的形成
亲水性的聚合物溶液 熵增——混合——自发 与分子数目有关 分子间作用力 与分子大小有关 聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液 发生分相的现象. 相图:相平衡时物系的组成,温度与压力的关系.
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双水相的形成
双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS)
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生化分离方法比较
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2.1 双水相体系介绍
一、 双水相的形成 在聚合物~盐或聚合物~聚合物系统混合时，会 出现两个不相混溶的水相。如在水溶液中的聚 乙二醇(PEG)和葡聚糖。当各种溶质均在低浓度 时，可得到单相液体，但当溶质的浓度增加时， 溶液会变得浑浊，在静止的条件下，会形成两 个液层，两个不相混溶的液相达到平衡，此时 上层富集了PEG，而下层富集了葡聚糖，这两个 亲水成分是非互溶的。
m0 (VB B VA A ) CO
m A V A AC A
VB B mB VA A m A
mo、mB和mA分别为总质量、在下相和在上相的聚合物质量 V,ρ和C分别为相体积、密度和聚合物的浓度； 下标O、B、A分别代表有机混合物(O)和下相(B)、上相(A)。
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双水相萃取的优点(二)
操作条件温和，在常温常压下进行； 两相的界面张力小，一般在10-4N／cm量级，两 相易分散; 两相的相比随操作条件而变化； 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。
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常见双水相系统
• 双聚合物体系 聚乙二醇/葡聚糖（PEG/Dextran） 聚丙二醇/聚乙二醇 甲基纤维素/葡聚糖体系 • 单聚合物-盐体系 聚乙二醇/硫酸钾体系（PEG/KPi） 聚乙二醇/磷酸铵体系 聚乙二醇/硫酸钠体系
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双水相萃取（aqueous two-phase extraction）具有收率高、成本低、可 连续化操作等技术优势，因而已被广泛应用于生物化学、细胞生 物学和生物化工等领域，进行生物转化，蛋白质、核酸等产品的 分离纯化。用此方法提纯的酶已达数十种，其分离也达到了相当 规模。近年来又进行了双水相萃取氨基酸类和病毒小分子物质的 研究，大大扩展了应用范畴并提高了选择性，使双水相萃取技术 具有更大的潜力和美好的发展前景。
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2.3 影响物质分配平衡的因素
影响物质在双水相系统中分配的因素主要有双水 相系统的聚合物组成(聚合物类型、平均分子量)，盐 类(离子的类型和浓度、离子强度、pH值)，溶质的物 理化学性质(分子量、等电点) 及温度等。多种因素 致使要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。 两种不同聚合物的溶液混合时，存在三种情况： ① 完全混溶性(匀相溶液)； ② 物理的不相容性(相分离)； ③ 复杂的凝聚(相分离，聚合物聚集在同一相中； 纯溶剂水聚集在另一相中)。 当两种离子聚合物带有相反电荷时，它们互相吸引 并发生复杂的凝聚。 34
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两相系统中如有盐存在，会对大分子在两相间的分 配系数发生改变
双水相萃取-无机盐的分配
在不同体系中，无机盐分配系数是不同的。在8% PEG 4000 /8% Dx500双水相体系中，无机盐的分配 系数如下
正离子 负离子
K AZ
K+ Na+ NH4+ Li+ 0.824 0.839 0.92 0.996 IBrClF-
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图 的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的 增大而增大。将盐对pro的HF影响上 式得： 其中HFSsalt 为盐增加而引起的HFS值增 量。因此，m的一般形式
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存在问题：当系线长度 增加时,系统的表面张力 增大,可能导致溶质在界 面上的吸附。这种现象 在处理含细胞和固体微 粒的料液时尤为严重， 细胞或固体微粒容易集 中在界面上，给萃取操 作带来因难，但对于可 溶性蛋白质，这种界面 吸附现象很少发生,一般 可不考虑。
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
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聚合物不相溶性： 1)各个聚合物分子，都倾向于在其周围有相 同形状、大小和极性分子，由于不同类型分子 间的排斥力大于与它们的亲水性有关的相互吸 引力，因此聚合物发生分离，形成二个不同的 相→聚合物不相溶性。 2)某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时， 只要浓度达到一定范围时，体系也会形成两相， 成相机理目前还清楚。（盐析作用）
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(2)混溶性