常规抗血清的制备方法
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抗原
表位A 表位B 表位C
克隆A
多
克
隆
克隆B
抗
体
克隆C
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单克隆抗体
单克隆抗体 由一个识别单一抗原决定
簇（表位）的B细胞克隆所产 生的同源抗体。
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杂交瘤技术
通过融合经免疫的小鼠脾 细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞， 以获得同时具有抗体分泌功能 和保持细胞永生性特征的杂交 瘤细胞克隆。是获取单克隆抗 体的主要技术途径。
第7页/共36页
采集方法
一次性采集 多次性采集
第8页/共36页
抗血清的分离与灭活
血清析出的温度 血清的灭活
第9页/共36页
第二节 单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体与杂交瘤技术 二、单克隆抗体的制备过程 三、单克隆抗体的特性
第10页/共36页
单克隆抗体与杂交瘤技术
1、单克隆抗体 2、杂交瘤技术
一、抗体纯化的目的与方法 二、纯化抗体的鉴定与保存
抗体纯化的目的
1、去除杂蛋白 2、去除杂抗体 3、去除非同类抗体
抗体纯化的方法
1、盐析、层析技术 2、抗原吸附
纯化抗体的鉴定
1、多克隆抗体的鉴定 2、单克隆抗体的鉴定
纯化抗体的保存
1、4。C保存 2、— 20。C保存 3、冷冻干燥保存
本章小结
1、多克隆抗体的制备 2、杂交瘤技术的原理与应用 3、单克隆抗体的概念与特点 4、抗体的纯化与鉴定
思考题
1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异
2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？
3、如何对获取的抗体进行鉴定？
单克隆抗体制备过程
1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞的准备 3、细胞融合 4、选择性培养 5、抗体分泌细胞的筛选 6、克隆化过程 7、单克隆抗体的制取
抗原
选择性 培养
单抗纯化
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞
融合
抗体分泌 细胞筛选
克隆化
单抗制取
单抗鉴定
致敏淋巴细胞的准备
动物选择：品系、年龄、性别、健康状态
1ml
培养液 10ml
离心
37。C摇动、 离心
1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm
10min 静止1.5min 7min
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
选择性培养
随机融合后的细胞类型 HAT选择培养原理
随机融合后的细胞类型
细胞组合
淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤
特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1
0.5-5 0.005-0.025
无关Ig含量（mg/ml）
10
0.5-1
—
其他血清蛋白
大量
极少
—
均一性
—
+
+
特异性
多决定簇 单决定簇 单决定簇
稳定性
较好
略差
略差
重复性
差
好
好
单克隆抗体的特性
1、理化性状高度均一 2、抗原结合性高度特异 3、生物活性高度单一
第三节 抗体的纯化与鉴定
对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测 快——迅速取得检测结果 准——检测结果可靠性高 灵——检测方法灵敏度高
常用筛选方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等
克隆化过程
概念：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
有限稀释法
计数
103/ml 102/ml 10/ml 0.5-2/孔
单克隆抗体的制取
制取方式： 体外——培养罐法 体内——腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定——是否针对同一决定簇
多抗与单抗制剂的比较
多抗
单抗
单抗
（血清） （腹水） （培养上清）
第一节 常规抗血清的制备方法
一、动物的免疫 二、抗血清的采集
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动物的免疫
1、免疫动物的选择 2、抗原接种 3、佐剂的应用
第2页/共36页
wenku.baidu.com 免疫动物的选择
种属与品系 经济性 “R”型与“H”型 经验性适配
第3页/共36页
抗原接种
剂量： 注射途径： 间隔与免疫时间： 接种次数：
第4页/共36页
抗原接种：方式——体内、体外 剂量——0.5-100g 次数——视抗原而定 间隔——视抗原而定 佐剂——视抗原而定
收集时间：末次接种后72h
骨髓瘤细胞的准备
细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态
细胞融合
方式：物理、化学、生物 PEG融合要点：（见图）
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞 50%PEG
HGPRT
+ + — + —
生长状态
长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
核苷酸从头合成途径 （de novo synthesis）
核苷酸补救合成途径 （salvage synthesis）
氨基碟呤 （A）
HAT 核苷酸
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧 啶核苷 （T）
DNA
HAT选择培养原理
抗体分泌细胞的筛选
佐剂的概念与种类
概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。
种类：非免疫原性物质 免疫原性物质
第5页/共36页
佐剂的作用机理
延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
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抗血清的采集
1、采集方法 2、血清的分离与灭活
抗原
表位A 表位B 表位C
克隆A
多
克
隆
克隆B
抗
体
克隆C
第12页/共36页
单克隆抗体
单克隆抗体 由一个识别单一抗原决定
簇（表位）的B细胞克隆所产 生的同源抗体。
第13页/共36页
杂交瘤技术
通过融合经免疫的小鼠脾 细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞， 以获得同时具有抗体分泌功能 和保持细胞永生性特征的杂交 瘤细胞克隆。是获取单克隆抗 体的主要技术途径。
第7页/共36页
采集方法
一次性采集 多次性采集
第8页/共36页
抗血清的分离与灭活
血清析出的温度 血清的灭活
第9页/共36页
第二节 单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体与杂交瘤技术 二、单克隆抗体的制备过程 三、单克隆抗体的特性
第10页/共36页
单克隆抗体与杂交瘤技术
1、单克隆抗体 2、杂交瘤技术
一、抗体纯化的目的与方法 二、纯化抗体的鉴定与保存
抗体纯化的目的
1、去除杂蛋白 2、去除杂抗体 3、去除非同类抗体
抗体纯化的方法
1、盐析、层析技术 2、抗原吸附
纯化抗体的鉴定
1、多克隆抗体的鉴定 2、单克隆抗体的鉴定
纯化抗体的保存
1、4。C保存 2、— 20。C保存 3、冷冻干燥保存
本章小结
1、多克隆抗体的制备 2、杂交瘤技术的原理与应用 3、单克隆抗体的概念与特点 4、抗体的纯化与鉴定
思考题
1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异
2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？
3、如何对获取的抗体进行鉴定？
单克隆抗体制备过程
1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞的准备 3、细胞融合 4、选择性培养 5、抗体分泌细胞的筛选 6、克隆化过程 7、单克隆抗体的制取
抗原
选择性 培养
单抗纯化
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞
融合
抗体分泌 细胞筛选
克隆化
单抗制取
单抗鉴定
致敏淋巴细胞的准备
动物选择：品系、年龄、性别、健康状态
1ml
培养液 10ml
离心
37。C摇动、 离心
1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm
10min 静止1.5min 7min
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
选择性培养
随机融合后的细胞类型 HAT选择培养原理
随机融合后的细胞类型
细胞组合
淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤
特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1
0.5-5 0.005-0.025
无关Ig含量（mg/ml）
10
0.5-1
—
其他血清蛋白
大量
极少
—
均一性
—
+
+
特异性
多决定簇 单决定簇 单决定簇
稳定性
较好
略差
略差
重复性
差
好
好
单克隆抗体的特性
1、理化性状高度均一 2、抗原结合性高度特异 3、生物活性高度单一
第三节 抗体的纯化与鉴定
对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测 快——迅速取得检测结果 准——检测结果可靠性高 灵——检测方法灵敏度高
常用筛选方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等
克隆化过程
概念：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
有限稀释法
计数
103/ml 102/ml 10/ml 0.5-2/孔
单克隆抗体的制取
制取方式： 体外——培养罐法 体内——腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定——是否针对同一决定簇
多抗与单抗制剂的比较
多抗
单抗
单抗
（血清） （腹水） （培养上清）
第一节 常规抗血清的制备方法
一、动物的免疫 二、抗血清的采集
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动物的免疫
1、免疫动物的选择 2、抗原接种 3、佐剂的应用
第2页/共36页
wenku.baidu.com 免疫动物的选择
种属与品系 经济性 “R”型与“H”型 经验性适配
第3页/共36页
抗原接种
剂量： 注射途径： 间隔与免疫时间： 接种次数：
第4页/共36页
抗原接种：方式——体内、体外 剂量——0.5-100g 次数——视抗原而定 间隔——视抗原而定 佐剂——视抗原而定
收集时间：末次接种后72h
骨髓瘤细胞的准备
细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态
细胞融合
方式：物理、化学、生物 PEG融合要点：（见图）
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞 50%PEG
HGPRT
+ + — + —
生长状态
长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
核苷酸从头合成途径 （de novo synthesis）
核苷酸补救合成途径 （salvage synthesis）
氨基碟呤 （A）
HAT 核苷酸
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧 啶核苷 （T）
DNA
HAT选择培养原理
抗体分泌细胞的筛选
佐剂的概念与种类
概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。
种类：非免疫原性物质 免疫原性物质
第5页/共36页
佐剂的作用机理
延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
第6页/共36页
抗血清的采集
1、采集方法 2、血清的分离与灭活