“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定一实验目的及要求：为了从自然界获得产淀粉酶活力较高的菌株,从面粉、储存面仓、发霉玉米等样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌，并对产淀粉酶菌的生理生化进行了探讨。
从面粉中得到的产淀粉酶菌共有三种，颜色有红色和白色。
从其菌体形态初步了解其特征，随后用唯一碳源实验、葡萄糖酵解实验、过氧化氢酶实验等分析并鉴定其生理生化特性。
二名词定义：淀粉酶分离鉴定淀粉酶 amylase，AMY,AMS一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。
根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
微生物的酶几乎都是分泌性的。
此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。
因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。
另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。
一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。
β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。
作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。
简答题 设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,并加以必要
简答题设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,
并加以必要
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
实验六产淀粉酶细菌的分离筛选
吸取稀释液 无菌操作法分别吸取10-3、10-4 土壤稀释液0.1mL，分别加在 已制好的2块淀粉平板培养基上。
涂板 用涂布棒将稀释液在培养基上充分混匀铺平，静置5min
划线分离 将10-1土壤稀释液用接种环挑取一环，每人在一块淀粉培养 基上进行划线分离。然后倒置于恒温箱培养。看演示
培养 倒置于房间37℃恒温箱培养24小时。
观察水解圈的产生，并测量其半径
24小时后(定时间），在之前稀释涂布和划线的3块 淀粉培养基上选取典型细菌菌落（尽量选取边缘整 齐和规则的菌落），测量其菌落半径（C值）并用 记号笔进行编号、记录。
然后将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的1 块淀粉培养基平板上分别点种。演示
2
1
12 3
加入碘液到长有菌落的3块淀粉培养基上，观察是 否有水解圈的产生，并测量其半径（H值） 。
制备土壤稀释液，
振荡5min，即为稀释10-1的土壤悬液。然后在离心管中依次 稀释至10-3、10-4 稀释度。 制备淀粉培养基平板
每组制5块牛膏蛋胨培养基平板 具体制法为：倒入融化好的牛膏蛋胨培养基约15 ml后 （温度为不烫手为宜），置于桌面冷却为固体平板。在无菌 培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
实验六 产淀粉酶细菌的分离筛选
实验目的
掌握分离筛选产生淀粉酶细菌的方法 学习酶活分析
实验材料
样品：新鲜土壤样品（同学自备）。 培养基：淀粉培养基。 无菌水：带有玻璃珠装有18mL无菌水三角瓶。 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌离心管、 电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴。
实验步骤
对照备用点种平板和编号菌落的水解圈大小，挑 取水解圈最大的一个菌斑（计算H/C），用记号笔 将其勾选出来。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计⽅案产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选⼀、实验⽬的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微⽣物的完整操作步骤。
2.巩固以前所学的微⽣物学实验技术。
3.学习淀粉酶活性的测定⽅法。
⼆、实验原理：1.α-淀粉酶是⼀种液化型淀粉酶，它的产⽣菌芽孢杆菌，⼴泛分布于⾃然界，尤其是在含有淀粉类物质的⼟壤等样品中。
2.从⾃然界筛选菌种的具体做法，⼤致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。
a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究⼀下⾃⼰打算筛选的微⽣物在哪些地⽅分布最多，然后才可着⼿做各项具体⼯作。
在⼟壤中⼏乎各种微⽣物都可以找到，因⽽⼟壤可说是微⽣物的⼤本营。
例如厨房⼟壤、⾯粉加⼯⼚和菜园⼟壤中淀粉的分解菌较多。
b)富集培养：富集培养就是在所采集的⼟壤等含菌样品中加⼊某些物质，并创造⼀些有利于待分离微⽣物⽣长的其他条件，使能分解利⽤这类物质的微⽣物⼤量繁殖，从⽽便于我们从其中分离到这类微⽣物。
c)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使⽤选择培养基对菌种进⾏培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出⽬的菌种，从⽽进⾏培养。
ii.（鉴别培养基）初筛利⽤鉴别培养基，通过添加⼀些特殊的试剂或成分来鉴别出⽬的菌种，从⽽筛选出来并对其进⾏培养。
d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的⽬的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从⽽得到纯种的菌落。
纯种分离的⽅法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢⼦或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进⾏性能测定后才能决定取舍。
三、实验材料：1.培养基配制：a)培养基按以下⽐例配制后，加蒸馏⽔调⾄100%；b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋⽩胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、琼脂粉0.8%、⽜⾁膏0.5%、pH7.0；c)分离培养基：⽟⽶粉2%、黄⾖饼粉1.5%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加⼊）、Na2HPO40.2%、pH7.0。
实验土壤中产淀粉酶菌株的筛选
实验1-5 产淀粉酶菌株的筛选及诱变系列实验
实验需知
实验分组：2个实验室，每个实验室分6组（名 单上报），每次实验结束留1组同学值日
实验成绩：占期末总成绩的20%，包括实验出 勤、实验操作、实验结果及实验报告撰写
实验结束：将实验用品收拾整齐，由实验老师 确认实验结束后方可离开
7. 产淀粉酶菌株的增殖培养
液体培养基分装：10ml/瓶，每个菌株对应1瓶（ 每组1-2瓶，参考鉴定结果）
液体培养基接种：用接种环从固体培养基表面上 沾取少许菌苔，将接种环在液体培养基内振摇几 次即可。
做好标记，放入摇床中振荡培养24h。
8. 产淀粉酶菌株的纯化——平板划线法
灼烧接种环，冷却后用接种环挑取少量菌苔 左手持平皿，将皿盖打开一条缝隙，右手将接种
稀释
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
1g
10ml 10-1
9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
分离
Hale Waihona Puke 实验步骤5.各组做好标记，置于30 ℃恒温培养48 h （倒置培养？？）
6. 产淀粉酶菌株的鉴定（下次课）
6. 产淀粉酶菌株的鉴定
实验结束后请各组同学务必与实验老师处签到后方 可离开，否则记为缺勤
最后一组同学使用完超净台后，需将台内废液、使 用过的枪头等清理干净，移液枪调回最大量程，并 用酒精棉球将台面擦拭干净后，打开紫外灯照射。
希望提出指导与建议
霉菌菌落特点
大而疏松，呈绒毛状（曲霉）、絮状（毛霉） 、地毯状（青霉）或蜘蛛网状（根霉）
有的无固定大小，延至整个培养基中 产色素，使菌落显色
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产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选
一、实验目的：
1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
2.巩固以前所学的微生物学实验技术。
3.学习淀粉酶活性的测定方法。
二、实验原理：
1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其
是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初
步筛选、分离纯化和性能测定。
a)采样：即采集含菌种的样品
采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最
多，然后才可着手做各项具体工作。
在土壤中几乎各种微生物都可以找到，
因而土壤可说是微生物的大本营。
例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中
淀粉的分解菌较多。
b)富集培养：
富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利
于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁
殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。
c)初步筛选：
i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊
成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。
ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。
d)分离纯化：
通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其
中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。
纯种分离的方法很多，主要有：平板
划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
e)性能测定：
分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必
须要进行性能测定后才能决定取舍。
三、实验材料：
1.培养基配制：
a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%；
b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏
0.5%、pH7.0；
c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4
0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后
加入）、Na2HPO40.2%、pH7.0。
2.主要试剂和溶液的配制：
a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液
中。
b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸
c)1%的3，5-二硝基水杨酸：精确称取1g3，5-二硝基水杨酸，溶于20ml
2mol/L氢氧化钠溶液中，加入蒸馏水50ml，再加入四水酒石酸钾钠30g，待
溶解后用蒸馏水定容100ml，盖紧瓶塞，隔绝CO2。
d)0.1%葡萄糖溶液：准确称取80℃烘干至恒重的无水葡萄糖0.1g，去离子水溶
解后定容至100ml。
e)0.1%标准麦芽糖溶液：称取麦芽糖100mg，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
四、实验方法：
1.采样与稀释：
a)从实验楼前的小树林中采集土样，称取5g土样，放入装有45mL无菌水的三
角瓶中, 震荡 20m in后静置 5min。
然后对其进行浓度梯度稀释到10-6, 分别稀
释到10-4、10-5、10-6浓度下。
2.富集培养：
a)从上述土壤稀释液中各取1 mL注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷却
至50℃左右的富集培养基，小心摇动冷凝后，倒置于37℃保温箱中培养24
小时。
3.初步筛选：
a)培养24小时后，取出平板，向平板中注入1滴革兰氏碘液，因淀粉遇碘变蓝
色，如菌落周围有无色透明圈，说明该菌能分解淀粉，即该菌株可以产生淀
粉酶。
通过影印法或点种法将可以产生淀粉酶的菌株接种到相同的无菌培养
中，重复操作进行培养。
4.分离纯化：
a)初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行
划线分离。
将划线分离后的培养皿放入37 ℃培养箱中培养24小时。
5.性能测定：
a)标准曲线的制作：
i.取7支20ml预先洁净灭菌干燥的试管，编号，加入试剂见表1。
每个浓度
做3个平行样本。
摇匀，至沸水浴中煮沸5min。
取出后流水冷却，加蒸
馏水定容至20ml，以1号管作为空白调零点，在520nm的波长下比色
测定吸光度值，并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。
表1 淀粉酶标准曲线的制作
b)酶活力测定：
i.首先制备待测粗酶液：取培养好菌株的分离培养基进行4000rpm离心
20min，并收集上清液即为待测粗酶液。
ii.取20ml预先洁净灭菌干燥的具塞刻度试管，编号。
并按步骤操作：取粗酶液1.0ml →加2%的可溶性淀粉1ml，蒸馏水3ml，于60 ℃水
浴中预热5min →加0.1ml/l柠檬酸缓冲液（pH6.0）1ml于
60 ℃水浴中保温30min →加3，5-二硝基水杨酸1.5ml，沸水
浴中煮沸5min，迅速冷却，加蒸馏水定容至20ml。
iii.空白对照：取粗酶液1.0ml，加入pH1.0的盐酸钝化淀粉酶，使酶失活，在按照以上步骤操作。
定容、摇匀后，用分光光度计测定520nm处的OD
值。
iv.在上述条件下，以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。
五、结果与分析：（待测）。