酵母人工染色体载体
人造染色体载体是什么？
人造染色体载体是什么？对一些大型染色体组的序列分析往往需要克隆具有数十万甚至上百万个碱基对的DNA片段，为了满足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者构建了人造染色体载体，如酵母人工染色体克隆载体、细菌人工染色体克隆载体等。
酵母人工染色载体(YAC)是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90min。
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒(TEL)。
YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因。
细菌人工染色体载体(BAC)是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶。
BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。
新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的Not工酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子。
Not Ⅰ识别序列，位点十分稀少。
重组子通过Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。
Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。
P1人工染色体载体(PAC)结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。
然而除了将连接产物包装进λ噬菌体颗粒以及在cre—loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组PAC也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持。
基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60～150kb之间。
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
4人工染色体载体
五、 cosmid克隆载体（自学P72）
❖ 常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和 KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性 内切酶的单一酶切位点。采用这的 阳性检出率，而且极其适合高等真核基因 的克隆工作。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子， 并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足 够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
05.04.2021
27六、 构建cosmid应注意哪些问题❖ ①载体分子的自身连接，从而导致效率降低 或者失败。
载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右
，因此往往会出现载体同载体自身连接，结
果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体
连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载
体分子自身连接；
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在成功构建pYAC4克隆载体的基础上，进一 步构建了人类人工染色体(HAC)克隆载体和哺乳 动物人工染色体(MAC)克隆载体。
选择标记--Sup4
❖ Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色 表型(成为白色)。
❖ 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌， 转化子的菌落呈白色。
❖ 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体， 其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生 的转化子形成赭色菌落。
酵母人工染色体载体
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
第4章人工染色体载体
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二、粘粒载体的工作原理
粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体 载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体 相当于l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过 粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联 体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时 l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两 个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片 段包装到l噬菌体颗粒中去。
第四章 人工染色体载体
第一节 第二节 第三节 第四节
粘粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
本课件是在网络资源基西础南大上学改生物进技而术成专业，基在因此工程对有关人士特致感谢！ 1
常规载体在工作时都是在不影响质粒或 噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的， 同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一 来，这些载体所装载的容量就受到限制。利 用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段的载 体称为人工染色体载体，其装载外源DNA片段 的容量可以与 多个外源片段串联进入载体中 原料DNA片段短于200kb时，制备的目的DNA中相当一部分
的末端的一端不带酶切位点
总DNA纯度影响目的DNA的制备 西南大学生物技术专业 基因工程
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第节 细菌人工染色体载体
细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
F质粒：是一个约100kb的质粒，编码60多种参 与复制、分配和结合过程的蛋白质。
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片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成
红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落 为白色。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
yac构建基因文库的原理
yac构建基因文库的原理基因文库是DNA片段的集合，其中每个片段都包含来自基因组的某个部分。
这些片段可以来自不同的染色体区域，并且可能包含整个基因或其部分。
YAC（酵母人工染色体）是一种用于构建基因文库的载体，它允许研究人员在酵母细胞中克隆和表达大片段的基因组DNA。
下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理，主要包含以下几个方面：1. 构建构建YAC载体的第一步是制备适合克隆大片段DNA的载体。
通常，YAC载体包含一个选择标记（如抗性基因），允许在含有特定抗生素的培养基上筛选和识别含有YAC的克隆。
此外，YAC载体还应包含一个多克隆位点，用于插入感兴趣的基因组DNA片段。
2. 转化一旦制备了YAC载体，就可以将其转化到酵母细胞中。
转化过程通常涉及将酵母细胞与YAC载体共孵育，以使载体与酵母细胞的DNA结合。
然后，通过加入选择标记来筛选和识别成功转化的细胞。
3. 克隆化在成功转化后，研究人员需要筛选和识别含有重组YAC载体的细胞克隆。
通常，这可以通过多轮筛选和鉴定来完成。
首先，研究人员可以使用特定抗生素来筛选含有选择标记的细胞。
然后，他们可以使用 Southern 印迹分析或 PCR 等技术来鉴定含有重组YAC载体的克隆。
4. 筛选筛选是YAC构建基因文库的关键步骤之一。
通过筛选，研究人员可以识别包含所需基因组区域的有效克隆。
这通常涉及对重组YAC进行分子遗传分析，以确定其包含的基因组区域。
通过比较筛选结果和基因组图谱，研究人员可以选择正确的克隆用于进一步研究。
5. 鉴定一旦筛选出正确的克隆，研究人员需要对其进行进一步鉴定。
这可以通过一系列技术来完成，包括 Southern 印迹分析、PCR、测序和功能分析等。
通过这些技术，研究人员可以确定重组YAC中的基因组区域是否包含所需的目标基因或DNA片段。
此外，他们还可以验证克隆的可靠性和稳定性，以确保其可以用于进一步实验和研究。
总之，YAC构建基因文库是一个复杂的过程，涉及多个步骤和关键环节。
酵母人工染色体名词解释
酵母人工染色体名词解释酵母人工染色体是不同于野生型酿酒酵母的一种自组装的染色体，它包含了多个拟合于自身的人工功能模块。
该技术是一种基因工程的手段，它可以在细胞中稳定地表达外源基因，因此被广泛用于大量生产特定蛋白质等的生物工艺。
酵母人工染色体不仅可以用于蛋白生产，还可以用于碾磨药品的筛选、生物传感器等。
酵母人工染色体的名称中包括许多专业术语，下面我们来具体解释一下它的相关名词。
1. YAC(酵母人工染色体)YAC全称酵母人工染色体，是通过重组技术在自然含有酿酒酵母基因的端粒进行构建的。
在YAC中，长段DNA 可以被合成，然后以任意组合方式安置在酵母人工染色体上，这使得YAC成为了一个在酿酒酵母中稳定存在的人工染色体。
2. BAC（大肠杆菌人工染色体）BAC全称大肠杆菌人工染色体，一类完整的人工DNA 载体，可用于将大约300kb的DNA片段插入到大肠杆菌中。
其主要应用是研究基因的调控及表达模式，并用于生物工艺学、纯化重组蛋白以及创建高密度点图(系)等领域。
3. P1人工染色体P1人工染色体是另一种人工染色体，通常被设计成具有特定检测基因或特定功能的细胞向其直接植入特定基因。
它们也可以被用作高效的向线性染色体上整合基因的系统，作为染色体极配合体体内重组验系统，可用于测定基因，以及其他展示DNA片段的多米戈螺旋(曲线)系统。
4. 人工染色体人工染色体是指由人工合成的DNA序列组成的染色体，其中包括人工元件、核心染色体区域以及端粒等，满足构建染色体的基本要求。
目前，人工染色体经常用于从植物或动物细胞中扩增大长的DNA组件，再将其转移到另一个预先准备好的动植物中，从而扩展细胞学研究和治疗学应用领域的范围。
总的来说，酵母人工染色体是一种理解基因在不同层次上作用的途径。
它为我们提供了一个构建高度复杂的基因组的框架，对于我们理解基因的调控、维持、功能和遗传机理有着重要的意义，在医学、农业生产、食品工业等方面都具有重要的应用潜力。
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工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι切 开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在 该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母 细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去， 达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制 基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体 自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒 正常功能的所有顺式调控信息，可保 证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重组， 且能够稳定地复制；
7.HIS3顺序。
酵母人工染色体载体的构建：
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因 序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是 YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
优缺点
概念
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC) 是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早 构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵 母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min， 含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。
1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：
2. 在酵母人工染色体载体中，下面哪段基因片段中包含克 隆位点
A.CEN B.ARS
C.TEL
D.SUP4
4.SUP4顺序，为酵母细胞Trp-tRNA基 因的一个赭石突变抑制基因，其中包 含有克隆位点，在发生ade2-赭石突变的 宿主细胞中，如果没有外源基因的插 入，则突变基因表达受到抑制，受体 菌为Ade+，形成白色菌落；当有外源 基因插入时，则SUP4表达将被阻断， 抑制作用消除，受体菌为Ade-，菌落为 红色，从而便于重组子的筛选；
由于人工染色体载体模拟了染色体的复制方式，因此能装载较 大片段DNA，从40kb到几百kb，甚至超过1000kb。
目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（BAC） 酵母人工染色体载体（YAC）
黏粒载体（ cosmid ） P1人工染色体载体（PAC）
酵母人工染色体
概念 基本功能单位 构建 工作原理
YAC载体的优缺点：
优点： 1.它的突出优点是可容纳比其他基因载体大得多的外源DN其基因表达和复制机制在理论上与正常染色体上的基因相似， 因此，有助于基因功能的鉴定。
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2.YAC载体的局限性
1.存在嵌合现象。即在单个YAC中的插入片段可能来自2个或 多个不同的基因片段，研究表明，嵌合体的比例可以达到10%50% 2.稳定性差，在继代培养时插入片段可能出现重排和丢失等现 象。这对染色体物理图谱的构建和基因分离十分不利 3.插入片段的分离纯化等难度大 4.重组子的转化效率低
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为 人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色体的 大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、分配 区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段 的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
5.TRP1和URA3顺序，分别是酵母色氨 酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1-和ura3-的野 生型等位基因，在相应的营养缺陷型 酵母细胞中可作为选择标记，如果将 YAC转入trp1-和ura3-宿主菌后，则转化 子能在选择性培养基上生长
6.ori和ampr，分别为质粒pBR322的复制起点和氨苄青 霉素抗性基因，可使YAC在大肠杆菌中复制和扩增以 及便于筛选
在基因工程中，外源基因片段难以直接进入受体细 胞内，即使采用特定的理化方法将其导入受体细胞，也 很难在受体细胞内维持完整行，更不用说大量复制或表 达,因此在基因工程中需要用到基因克隆载体。
克隆载体实际上是一种具有特定功能的DNA分子， 它们将携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其 在受体细胞中得以维持或表达。目前构建并得以应用的 克隆载体数以千计，根据构建克隆载体的DNA来源不同 分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、植物病毒载体、 动物病毒载体、人工染色体载体等。
3.ARS1顺序，来源于酵母第4号染色体， 可保证YAC在酵母细胞中自主复制
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母 中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序列、 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN）和两个 端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染色体在子 代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
常规的载体在工作时都是在不影响质粒或噬菌体复制 功能的基础上装载外源DNA片段的，同时保持质粒和噬菌 体的基本特性。这样一来，这些载体所装载的容量就受到 限制。
人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆 数百甚至上千 kb 的DNA片段，此时质粒和噬菌粒载体的 装载量也远远不能满足需要。
人工染色体载体