沙门氏菌几种检测方法简介与比较共34页
沙门氏菌基本知识及检测方法
沙门⽒菌基本知识及检测⽅法沙门⽒菌基本知识及检测⽅法沙门⽒菌属(Salmonella)是肠杆菌科的⼀个⼤属，有2000多个⾎清型，我国发现的约有100个。
沙门⽒菌⼴泛存在于猪、⽜、⽺、家禽、鸟类、⿏类等多种动物的肠道和内脏中。
1880年Eberth⾸先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较⼤，遂定名为沙门⽒菌属Salmonella 。
本属细菌绝⼤多数成员对⼈和动物有致病性，能引起⼈和动物的败⾎症与胃肠炎，甚⾄流产，并能引起⼈类⾷物中毒，是⼈类细菌性⾷物中毒的最主要病原菌之⼀。
根据沙门⽒菌的致病范围，可将其分为三⼤类群。
第⼀类群：专门对⼈致病。
如伤寒沙门⽒菌、副伤寒沙门⽒菌(甲型、⼄型、丙型)。
第⼆类群：能引起⼈类⾷物中毒——⾷物中毒沙门⽒菌群，如⿏伤寒沙门⽒菌、猪霍乱沙门⽒菌、肠炎沙门⽒菌、纽波特沙门⽒菌等。
第三类群：专门对动物致病，很少感染⼈，如马流产沙门⽒菌、鸡⽩痢沙门⽒菌。
致病性最强的是猪霍乱沙门⽒菌(Salmonella cholerae)，其次是⿏伤寒沙门⽒菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门⽒菌(Salmonella enteritidis)。
⼀、沙门⽒菌属的⽣物学特征：1.形态染⾊特性：G-⽆芽孢杆菌。
⼤⼩通常为0.7～1.5µm ×2.0～5.0µm，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，⽆荚膜，除鸡⽩痢沙门⽒菌和鸡伤寒沙门⽒菌外均有周⾝鞭⽑，能运动，绝⼤多数菌株有菌⽑。
需氧或兼性厌氧菌，⽣长温度范围为10～42℃，最适⽣长温度为37℃，适宜pH为6.8～7.8，对营养要求不⾼，在普通培养基中⽣长旺盛，胆盐可促进其⽣长。
2.培养特性：需氧或兼性厌氧菌；⽣长温度范围为10～42℃，最适⽣长温度为37℃；适宜pH为6.8～7.8；对营养要求不⾼，在普通培养基中⽣长旺盛；胆盐可促进其⽣长。
沙门氏菌的检测
• 硫代硫酸钠和枸橼酸铁用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；
• 中性红为pH指示剂，可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌鉴别开，前者为红色菌落，后者为无色菌落 • 发酵糖产酸的菌落呈红色，不发酵糖的菌落为无色； • 琼脂是培养基的凝固剂。
蛋白胨100g蒸馏水1000mlph7002牛肉膏50g氯化钠30g碳酸钙450g碳酸钙可以调节ph是培养基在养菌过程中维持一定ph否则ph过低影响菌株生长另外还有筛选产酸菌的作用除碳酸钙外将各成分加入蒸馏水中煮沸溶解再加入碳酸钙调节ph高压灭菌12120min
一、实验目的 • 1.掌握沙门氏菌属的检测方法
水中， • 琼脂加入600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基
础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷 至50 ℃～55 ℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。
第十三页，共40页。
XLD HE 科玛嘉显色培养基平板
第三十页，共40页。
（4）生化试验 • 选择性琼脂平板上符合沙门氏菌特征的菌落，只能称其疑为沙门氏菌，也可能是其他杂菌。 • 五项生化试验：
– 三糖铁(TSI)试验
– 赖氨酸脱羧酶试验
– 靛基质试验 – 尿素琼脂培养
– 氰化钾培养基
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• 1.三糖铁(TSI)试验
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5.HE 琼脂 • 基础成分： • 蛋白胨 12.0g 牛肉膏 3.0g 乳糖 12.0g 蔗糖 12.0g • 水杨素 2 .0g 胆盐 20.0g 氯化钠 5.0g
沙门氏菌检测标准方法及实验关键点
沙门氏菌检测标准、方法及实验关键点．检验沙门氏菌的原因和意义：据统计我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的，人一旦摄入含有大量沙门氏菌(105～(106个/g)的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素作用下发生食物中毒导致胃肠炎、伤寒和副伤寒且沙门氏菌的传播媒介众多，肉、蛋以及食品从加工到出售的过程中都十分容易发生污染。
因此对沙门氏菌的检验事关重大。
二、检测及鉴定：沙门氏菌的检测要在二级生物安全实验室及二级生物安全柜(在负压情况下防止致病微生物气溶胶飘离实验室对实验人员及环境造成污染)中进行。
沙门氏菌典型菌落形态：生化鉴定显示：API20E 生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定法，广泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速鉴定。
限值要求：参考CAC、ICMSF、欧盟、澳大利亚和新西兰、美国、加拿大、香港、台湾等国际组织、国家和地区的即食食品中沙门氏菌限量标准及规定，《GB29921-2013食品中致病菌限量》按照二级采样方案对所有11类食品设置沙门氏菌限量规定，具体为n=5，c=0，m=0（即在被检的5份样品中，不允许任一样品检出沙门氏菌）。
三、沙门氏菌传统检测方法的关键控制点1、样品处理尽可能缩短解冻时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤致病菌取样一定要均匀并具有代表性（蛋黄蛋清混匀取样）。
2、培养基及培养方面（1）没有一种培养基可疑准确无误的筛选出沙门氏菌，必须选择多种选择性培养基同时筛选，只能说显色培养基综合选择性更强。
（2）试剂和培养基的配置一定要严格按照说明书配置，是否需要高压灭菌，添加剂用量及培养基保存条件。
（3）有1%沙门氏菌乳糖发酵阳性，为了避免漏检乳糖阳性菌必须选择不依赖乳糖的培养基，目前BS培养基认为是最适合的。
（4）BS培养基是分离沙门氏菌的高效培养基，特别适用于伤寒类的沙门氏菌，不是所有的选择性培养基都能有效分离出伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，BS是分离伤寒类沙门氏菌的首选培养基。
论沙门氏菌的检测方法
食品安全论沙门氏菌的检测方法沙门氏菌是食品微生物中致病菌的一种，下面介绍几种检测沙门氏菌的方法。
１、传统的培养方法用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，共有如下四步：（１）预增菌，将样品；ｇｒｉｎ培养基中，温度３７０Ｃ，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。
（２）选择增菌，使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，目前选择性培养基有３种类型：连四硫基盐肉汤、硒酸盐胱氨酸肉汤和ＩｋＶ培养基。
（３）分离，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认。
并对该菌落分离物进行生化和血清学检测，以做出鉴定。
２、以核酸为基础的方法所有的细胞都含有ＤＮＡ和ＲＮＡ这样唯一一类可携带信息的大分子，所以用它作为检测的标靶。
标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。
探针需要加附适当的标记，此法应用的探针含有放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌ＤＮＡ片段，其敏感性高，经约４８小时的增菌步骤后，检测极限可达１０８个细菌／ｍｌ。
目前，以核酸杂交为基础的第二代技术——比色计目前也已发展起来，此法依赖于沙门氏菌核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）——核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。
核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细菌细胞中存在５０００＂－２００００个复制体，而相比之下染色体ＤＮＡ复制体仅２—１０个。
这种天然富含ｒＲＮＡ标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。
３、以抗体为基础的检测方法利用抗原——抗体反应的特异性，进行细菌的鉴别和血清学定性。
细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在。
使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。
广泛采用的是以双位点ＥＬＩＳＡ技术即夹心ＥＬＩＳＡ为基础的方法。
此法是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到２０２００８年５期（上）文／王哲的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。
第四节沙门氏菌
TSI（排除A/A H2S－结果 ），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸
H2S＋ 靛＋ 尿－ KCN－ 赖＋ 甘露醇 山梨醇 沙门氏菌血清学试验 沙门氏菌血清学试验 H2S－ 靛－ 尿－ KCN－ 赖＋/－ ONPG － 沙门氏菌 非沙门氏菌
非如左述的各种反应结果
BPW:缓冲蛋白胨水 MM：氯化镁孔雀绿增菌液 TTB：四硫磺酸钠煌绿增菌液 SC：亚硒酸盐增菌液
生物学性状-形态特征
大小0.6～1.0×2～3um，无芽胞， 一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无 荚膜，多数有菌毛，
革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌 氧。
生物学性状-培养特性
最适生长温度为35～37℃，最适 pH值为6.8～7.8。 营养琼脂平板上：菌落大小一般 为2～3mm，光滑、湿润、无色、 半透明、边缘整齐。 血平板上：中等大小的灰白色菌 落。
5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定 。
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.4-2003
微生物学检验 沙门氏菌检验
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品
前增菌法 25g＋BPW225mL
36 ℃ ± 1 ℃ 一般4h，干蛋品18h～24h
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品
直接增菌法 25g＋灭菌生理盐水25mL 检样匀液25mL ＋MM （或TTB）100mL
目前至少有67种0抗原和2000以上血清型， 所致疾病称沙门菌病。
致病性-沙门菌病(salmonellosis)
肠热症 -----伤寒病和副伤寒病总称，由伤寒杆菌和 甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。两次菌血症。
急性肠炎（食物中毒）——最常见的沙门杆菌感染， 多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。
沙门氏菌
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LC/CEC-07
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共4页第4页
标题：沙门氏菌检测3MPetrifilmTM测试片法
4.16.加入终止液.酶标仪进行判定结果
5.判读结果.使用酶标仪
使用酶标仪在414±10nm处读取样品的吸光度值。如果使用单波长酶标仪，可用盛有200ul水的微孔板做空白.如果使用双波长，以空气做空白，参比波长为490±40nm
4.9.封好微孔后，将微孔板置于培养箱内36℃±1℃孵育30min
4.10.取出微孔板，冲洗微孔3次
4.11分别添加200ul结合物到每个微孔内。
4.12.封好微孔后，将微孔板置于培养箱内，36℃±1℃孵育30min
4.13.取出微孔板，冲洗微孔4次。
4.14.分别添加200ul底物到每个微孔内。
4.15.置于室温下放置10min后即可参照比色卡用肉眼判读颜色。。
。吸光度值大于等于0.3的样品为阳性。注意阳性对照液的酶标仪读数至少达到1.0，并且阴性对照液的酶标仪读数小于0.2.此试验结果有效。
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共4第3页
标题：沙门氏菌检测3MPetrifilmTM测试片法
4.操作步骤.
4.1取25g样品..
4.2充分均质.
4.3.前增菌：将均质好的样品.→无菌锥形瓶盛有225ml前增菌（乳糖肉汤）36℃±1℃培养18h～22h.
4.4选择性增菌：移取0.1ml前增菌液到9.9ml RV{R10}中培养.42℃±1℃. 16ｈ～20h
沙门氏菌检验方法(pdf 52页)
沙门氏 菌属
氏菌属
大肠菌群Coliform
变形杆
克雷伯
菌属
柠檬酸杆菌属
氏菌属
摩根菌 属
粪大肠菌群 Fecal Coliform
志贺氏 菌属
沙雷氏 菌属
克罗诺
肠杆菌属
……
大肠埃希氏菌属(大肠杆菌)E.Coli
出血性
侵袭性
致病性 非致泻
O157:H7
（非典
集聚性 产毒性
型）
目录
v 概述 v 致病性 v 细菌学特性 v 生化特性 v 血清学特性 v GB 4789.4-2010检验方法
产生乙酰甲基甲醇（V-P），对苯丙氨酸不脱氨 § 在氰化钾培养基上不生长
目录
v 概述 v 致病性 v 细菌学特性 v 生化特性 v 血清学特性 v GB 4789.4-2010检验方法
沙门氏菌血清学特性
v 抗原成份极为复杂，且有变种，因此这给血清分型带来很多困难，分 为菌体（O）、鞭毛（H）、荚膜（K、Vi）、纤毛抗原。其中菌体和鞭 毛抗原在沙门氏菌血清型的鉴别上很重要。 § O抗原：存在于细胞壁中，每一种沙门氏菌的光滑型菌株至少有一 种特异的菌体抗原，由于菌体抗原耐热性相对稳定，抗原不易丧失 或变异，因此菌体抗原已公认为沙门氏菌血清学分型的基础。O抗 原耐热，100℃~121℃加热2.5h，而不失去抗原性；用乙醇和1N盐 酸处理细菌，其抗原性不受影响。O凝集反应呈颗粒状。 § H抗原：系由不耐热的蛋白质组成，经加热和用乙醇及碱处理易变 性，失去凝集性，但不改变抗原性。加热100℃以上，H抗原会失去 活性。H凝集反应出现迅速，2h内即达最终效价。H凝集为絮状，松 散，轻摇易散开。 § K抗原：为Vi抗原和M抗原。Vi和M抗原，均为O抗原表面的荚膜抗 原，具有这种抗原的细菌，不被相应的O血清凝集。但100℃加热处 理后，虽然抗原不被灭活，而已从菌体表面脱落，游离于液体中， 从而暴露出O抗原，可以与0血清凝集。个别种有Vi抗原，如伤寒沙 门氏菌等 § 纤毛抗原：纤毛是一种比鞭毛更细小的纤维样结构物，含有蛋白性 的抗原物质。其纤毛能凝集豚鼠的红血球，该特性因加甘露糖而消 失，即谓1型纤毛。所有沙门氏菌的纤毛抗原性一样。
沙门氏菌几种检测方法简介与比较
每个平板选5个菌落
营养琼脂纯化可疑菌落
35℃ or 37℃ 18~24h
TSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚
血清学试验 （O抗原，Vi抗原，H抗原）
报告结果 送参考实验室分型
加拿大HPB方法
食品中沙门菌的分离和鉴定
25g样品
MFHPB-20
营养肉汤or缓冲胨水or煌绿 水溶液 or胰蛋白酶大豆肉汤
沙
门
应得 0 2 4 1 2 4 0 0 0 0 0 4 1 2 4 1 0 4 0 2 0 菌
树枝
组合
6
7
0
编码
4
7
5
2
API 20E
沙门菌检测显色培养基
沙门氏菌在海博公司显色培 养基上的菌落特征（红）
沙门氏菌在CHROMagar 显色培养基上的菌落特（紫）
DT 2R D
C
SE A
IN V G G M I S
D P E L A NO L U N OR
1 24 1 2 4 1 2 4 1 2 4
第6位数 第7位数 结
果 R S MA A O判 GA E MR X 定
ACL YA
1 24 1 24
反应 - + +
结果
+ ++
---
- - + + ++
+- + - +-
沙门菌仪器检测法
VIDAS 应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪 ，
用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕 捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合， 经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发 光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快， 可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆 菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡 萄球菌肠毒素等。
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沙门氏菌几种检测方法简介与比较
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。—ห้องสมุดไป่ตู้希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根