药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度检测操作步骤
微生物限度检测是对产品中微生物数量进行定量或定性检测的过程。
以下是一般的微生物限度检测操作步骤：
1. 准备工作：
-清洁和消毒实验室设备、试剂瓶和工作台等。
-准备所需的培养基、培养基平板和培养基管等。
2. 样品处理：
-取得待检样品，确保样品的采集和保存符合规范和要求。
-如果需要，将样品稀释到适当的浓度，以便在培养基上形成可数的菌落。
3. 培养基制备和接种：
-准备所需的培养基，并按照说明书的要求进行制备。
-将适量的培养基倒入无菌平板或管中，并在适当温度下固化。
-在培养基表面均匀涂布待检样品，或将待检样品滴于培养基管中。
4. 培养和孵育：
-将培养基平板放置在恒温培养箱中，按照规定的时间和温度进行培养。
-监控培养过程中的温度和湿度，确保适宜的条件。
5. 菌落计数和鉴定：
-培养结束后，观察培养基上的菌落情况。
-使用显微镜进行菌落计数和鉴定，根据形态、颜色、大小等特征确定菌落类型。
6. 结果分析和报告：
-根据菌落计数和鉴定结果，判断样品的微生物限度是否符合规定的标准。
-撰写检测报告，将结果详细记录并汇总，包括样品信息、检测方法、结果和结论等。
以上是一般微生物限度检测的操作步骤。
具体的操作可能会因实验室和产品类型而有所不同，需要根据相关标准和方法进行调整和执行。
在进行微生物限度检测时，应严格遵守实验室的操作规程和安全要求，确保检测结果的准确性和可靠性。
微生物限度检查法(2).控制菌检查方法验证讲义
5.联合使用
适用于抑菌作用较强的中西药制剂。 如：①复方洗必泰栓（水溶性基质）金黄 色葡萄球菌的检验—用1%吐温-80稀释液制 备供试液＋膜法过滤＋滤膜置含5%吐温-80 的硫乙醇酸盐增菌液中→（+）；②生白安 片（含盐酸小檗胺）大肠杆菌检验—低速 离心＋薄膜过滤法→（+）。
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3.薄膜过滤法
本法适用于有抑菌作用的液体制剂。 如：葡萄糖酸洗必泰含漱剂，氯霉素滴眼 剂等。 注意：供试液应加入较多量的稀释液稀释 后，再注入滤器中。
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4.中和法
①磺胺类可加对氨基苯甲酸（100ml增菌培养基 中含1%对氨基苯甲酸0.5-1.0ml）如：复方新诺明 片 ②含重金属盐类可用含巯基化合物（硫乙醇酸钠， L-胱氨酸）的培养基作增菌培养液。如：磺胺嘧 啶银软膏-金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌的检验 ③脂溶性药物用表面活性剂中和。如：复方痔疮 栓（含洗必泰）中的绿脓杆菌的检验，仅用吐温80制备供试液即可
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2.离心沉淀集菌法
低速离心（500转/分5分钟）取上清液（弃取抑菌 成分的固体微粒） 高速离心（3000-3500转/分30分钟）弃去上层抑 菌的液体部分，留管底2ml。 本法适用于抑菌作用不强的中西药品，如：平喘 胺片 、速效感冒片（先低速，后高速）；小儿惊 风散（低速离心）。本法操作较烦琐，药品中污 染的微生物有一定的损失。
方法:1.培养基稀释法 2.离心沉淀集菌法 3.薄膜过滤法 4.中和法 5.联合使用
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1.培养基稀释法
供试品加稀释剂稀释到一定倍数后进行检 验（虽然供试品中污染的菌也稀释，但由 于检验结果规定是不得检出，因而有些品 种用稀释法可检出目的菌）。 如百喘朋片[1：10 稀释液3ml 结果（＋） 试验菌28-96个] 。 本法适用于一般抑菌作 用不强的中西药品。
药品微生物限度检测技术PPT课件
检
喷雾剂供
查
试品
1.4.2供试品检查
非
无 菌
① 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法
产
品 微 生 物 限 度 检 查
除另有规定外， 取规定量供试 品，按方法适 用性试验确认 的方法进行供 试液制备和菌 数测定，每稀
培养和计数 ：除另有规定外， 胰酪大豆胨琼脂培养基平板 在30～35℃培养3天，沙氏葡 萄糖琼脂培养基平板在20～ 25℃培养5 天，观察菌落生 长情况，点计平板上生长的 所有菌落数，必要时可适当 延长培养时间至7 天进行菌落
微
生
1.3.3计数方法适用性试验
物
限
度
检
查
非 无
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
菌 1.3.1菌液制备及使用
产 品
菌种
微
试验用菌株的传代次数不得超过5
生
代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
物
限
种为第0代），并采用适宜的菌种
度
保藏技术进行保存，以保证试验菌
检 查
株的生物学特性
检
查
非
② 薄膜过滤法
无
除另有规定外，按计数方法适用性试
菌
验确认的方法进行供试液制备。取相
产
当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试 液，若供试品所含的菌数较多时，可
品
取适宜稀释级的供试液，照方法适用
微
性试验确认的方法加至适量稀释液中， 立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜， 培养和计数：培养条件
生
菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基 和计数方法同平皿计数
值报告菌数
非
③ MPN 法
无
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证是一种用于确定化妆品和药品中微生物污染水平的方法。
这种验证方法用于确定产品是否符合微生物限度规定，并确保产品的安全性和质量。
微生物限度方法学验证的步骤包括：
1. 根据相关规定选择适当的微生物限度测试项目。
常见的微生物测试项目包括总生菌数、霉菌和酵母菌、大肠菌群等。
2. 准备适当的培养基和培养条件，以促使微生物在培养基上生长。
3. 从样品中获取适当的微生物培养物。
样品可以是产品中的一部分或整个产品。
4. 在适当的培养基上接种微生物培养物。
5. 在适当的环境条件下孵育培养基，以促进微生物生长。
6. 定期检查培养基的生长情况，包括观察菌落形态和计数菌落数量。
7. 将菌落转移到适当的检测方法中，如涂抹法、膜过滤法等。
8. 使用适当的培养基和培养条件，在适当的温度和pH条件下，观察和计算培养基上的微生物生长数量。
9. 比较结果与规定的微生物限度标准，确定产品是否符合要求。
微生物限度方法学验证可以帮助制药和化妆品行业确保产品的微生物质量，并确保产品在使用过程中不会对消费者的健康有害。
这种验证方法需要严格的实验室操作和合理的测试标准，以确保结果的准确性和可靠性。
微生物限度方法学验证PPT课件
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
药品微生物限度检查法PPT教学课件
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操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-1996 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
• 取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂 酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化 混合物（温度低于45℃）的烧杯中，用无 菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的 稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充 分乳化，作为1:20供试液。
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特殊供试液制备方法
• 取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的 无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振 摇，使供试品溶解，再加入约45℃的稀 释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明 显分层，取其水层作为1:10供试液。
• 一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一 个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试 品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单 位数（colony forming unity, cfu）
• ·供试品检验的全过程必须符合无菌技术 要求。
• 培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按 灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的 灭菌程序灭菌。
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操作要点
• 作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。 • ·细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不
易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。 • 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定
• 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）
• 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3倍量供试品。
药品微生物验证实例
验证实验实例
• 黄连上清片
• 取供试品10g，置均质器中充分混匀后加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的 供试液。
验证实验实例
富马酸酮替酚滴鼻液 控制菌 需检查大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球 菌
验证实验实例
• 西洛他唑缓释片
• 按药典规定供试液应为1：10 • 但此缓释片配成1：10供试液时，其粘稠度 • 过大，不利于吸取供试液，所以将此类药物配制 成1：20供试液。
回收率测定实验
验证方法
试验组 取规定量最低稀释级的供试液，加入50～100cfu的菌 液，按平板菌落计数方法测定其菌数或薄膜过滤计数。 菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。 供试品对照组 测定供试品稀释液（本底）的菌数。 稀释剂对照组 取稀释液加入50～100cfu的菌液，按供试品组 供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次 试验菌的回收率。
一般口服制剂验证大肠埃希菌 外用制剂验证金葡和铜绿假单胞 含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证 含动物组织（包括提取物）口服制剂验证沙门菌 阴道给药制剂（中成药）验证梭菌
微生物限度检查样品
• 抽样量和检验量分别单列一项。 • 抽样量 一般抽样量为检验用量（2个以上最小 包装）的3倍。 • 检验量 指供试品一次检验的用量。一般为 10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微 量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙 门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。 • 验证实验按检验量执行。
控制菌检查方法验证
结果判定
阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检 出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法 进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试 验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜 过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消 除供试品的抑菌活性，并重新验证。 验证试验可与供试品的控制菌检查同 时进行。
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药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
二.菌液稀释计数方法细菌：大肠、金葡、枯草、铜绿稀释：营养肉汤作为稀释剂, 按10-2、10-4、10-5、10-6稀释级10-2 ：取新鲜浓菌液0.1ml→9.9ml充分打匀、10-4 ：取10-2 0.1ml→9.9ml充分打匀10-5：取10-4 1ml→9ml充分打匀，取0.2ml×2皿营养琼脂计数10-6：取10-51ml→9ml充分打匀取0.2ml×2皿营养琼脂计数生孢梭菌（厌氧梭菌）：硫乙醇酸盐流体培养基为稀释剂按上述步骤稀释至10-7。
10-5、10-6、10-7、分别用50ml硫乙醇酸盐流体培养基计数，各1-2支。
细菌计数：36±1℃培养24小时计数菌落数。
白色念珠菌： 0.9%氯化钠溶液作为稀释剂按上述步骤稀释至10-5、10-6计数。
黑曲霉浓菌悬液： 0.9%氯化钠溶液作为稀释剂按上述步骤稀释10-4、 10-5、10-6计数。
25-28℃培养24-36小时计数菌落数。
操作要点：1.新鲜浓菌液制备：挑取的菌落充分研匀并摇匀，注意各菌培养时间；2. 稀释菌液时每一步均应充分摇匀；3. 枯草芽孢杆菌新鲜浓菌液会形成膜或沉淀，稀释菌液时必须充分振摇后静置，取其无块状物的菌液；4. 黑曲霉接种时注意不能造成对接种环境的污染；点计菌落数时轻拿轻放以免造成计数误差。
11.5下午三.微生物限度检查方法选择预试验根据样品的溶解性、药效、可能存在的抑菌性等确定预试验方法。
计数（细菌、霉菌及酵母菌）验证一般选择顺序：平皿法、平皿稀释法、中和法+平皿稀释法、薄膜过滤法、离心500r/min3-5分钟上清液+平皿稀释法（细菌）、沉降+平皿稀释法（霉菌），离心沉淀集菌法（3000r/min20分钟）+平皿稀释法、离心500r/min3-5分钟上清液+薄膜过滤法（主要用于细菌计数验证）。
方法应在符合验证要求的前提下，考虑简便可行。
样品：感冒清热颗粒方法：平皿稀释法示教1. 供试液制备方法：样品10g+稀释剂90ml为1：10供试液。
（最低稀释级作为验证供试溶液）。
2.计数验证回收试验：试验组（各1-2皿）菌液组（各2皿）、供试品对照组（各2皿）↓↓↓1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+大0.5ml）大0.5ml 细 1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml 1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+金0.5ml）金0.5ml 霉 1ml 0.5ml1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+枯0.5ml）枯0.5ml1ml 0.5ml （+白0.5ml）白0.5ml1ml 0.5ml （+黑0.5ml）黑0.5ml（共55皿，按规定培养、计数菌落、计算回收率）3.根据回收试验结果确定敏感菌及各试验菌验证方法。
操作要点：1. 试验组：每皿加入1：10供试液应摇匀为均匀混悬液、量要准确、刻度吸管吸取方法一致。
平皿中1：10供试液与菌液尽可能不要接触，立即倾注培养基并充分混合均匀。
2. 计数验证加入50-100cfu 试验菌，菌液的体积以0.4ml-0.6ml为宜；既试验菌液应稀释为100-200cfu/ml ，放置2-8℃备用。
11.6上午验证试验：选择3个批号样品进行3次独立验证实验，证明方法的有效性；以敏感菌方法确定计数方法。
样品：感冒清热颗粒（不含原药材粉）根据预试验结果确定正式验证方法，预试验回收结果如下表：结果： 大肠埃希菌0.5ml 以下/皿（1ml 分注2个皿以上）回收均达到70%以上；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌0.2ml 以下/皿（1ml 分注5个皿以上）回收均达到70%以上。
白色念珠菌、黑曲霉按平皿法回收均达到70%以上。
菌 种( 代)批 号 回收率% 1ml 0.5 ml 0.2 ml 0.1 ml 大肠埃希菌（4）（1：10）20070102 65 81 81 91 金黄色葡萄球菌（4）（1：10）20070102 0 35 89 94 枯草芽孢杆菌（4）（1：10）20070102 0 43 83 93 白色念珠菌（4）（1：10） 2007010286 90 / 黑曲霉 （4）（1：10）20070102 91 901.计数方法验证：平皿稀释法：大肠0.5ml/皿；金葡、枯草0.2ml/皿。
白念、黑曲霉1ml/皿。
（每个大组作1个批号样品计数方法验证、控制菌大肠埃希菌检查方法验证）试验前准备：各试验菌液（100-200cfu/ml）、1：10供试液、平皿、吸管等、BL增菌液试验组菌液组（各2皿）、供试品对照组↓↓↓0.5ml+大0.5ml（4皿）大0.5ml 细0.2ml（6-10皿）0.2ml+金0.5ml（6皿）金0.5ml0.2ml+枯0.5ml（6皿）枯0.5ml1ml +白0.5ml（2皿）白0.5ml 霉 1ml （2皿）1ml +黑0.5ml（2皿）黑0.5ml（共44皿，按规定培养、计数）（注：若所验证的计数方法成立，供试品对照组采用10个皿就同时完成该批号样品细菌计数测定）2.大肠埃希菌检查方法验证试验组阴性菌对照组供试品对照组↓↓↓BL 100ml BL 100ml BL 100ml10ml 1：10供试液 10ml 1：10供试液 10ml 1：10供试液+大肠10-100cfu +金葡10-100cfu阴性对照：BL 100ml+稀释剂10ml操作要点：1.2.同方法选择预试验3. 正式验证各试验菌验证方法采用预试验结果中回收率在70%以上的方法进行，最终以敏感菌方法确定计数方法；也可采用各菌的回收率均在70%以上的方法进行。
11.7上午离心沉淀集菌法、薄膜过滤法（反复使用集菌器）示教两种方法可应用于有抑菌活性的样品，或与其他方法的联用。
离心500r/min3-5分钟取上清液 + 平皿稀释法（细菌）、沉降+平皿稀释法（霉菌、酵母菌），离心沉淀集菌法（3000r/min20分钟）+平皿稀释法、离心500r/min3-5分钟上清液+薄膜过滤法（主要用于细菌计数验证）。
离心机、刻度离心管（10ml、成对平衡）、吸头、2ml刻度吸管离心500r/min3-5分钟、离心沉淀集菌法（3000r/min20分钟）的操作方法：500r/min3-5分钟（用于细菌检测）：取上清液的方法及要求（上清液不应少于8ml，否则供试液应适当稀释）；3000r/min20分钟弃去上清方法及要求（留管底约2ml，当离心沉淀物超过2ml时供试液应适当稀释）。
薄膜过滤法（反复使用集菌器）操作方法：1. 滤膜（不大于0.45um）的选择及准备：水溶性供试液→水性膜：滤膜用水浸泡15分钟后装膜，121℃20分钟灭菌，不烘干，短时间内使；过滤前用稀释液饱和滤膜。
有机溶剂供试液→有机滤膜：滤膜、滤器过滤前使充分干燥。
2.供试液、菌液的加入：将供试液或菌液加入一定量冲洗液中混匀后再滤过，以免供试液直接吸附在滤膜上不易冲洗或试验菌集中在局部不能分散均匀难以计数。
3.过滤、冲洗：注意供试液、冲洗液覆盖整个滤膜表面，以发挥滤膜的最大过滤效率，少量多次冲洗效果较好。
总过滤量不宜过大，以避免微生物受损伤，。
4.取膜、贴膜：尽量抽干、菌面朝上，贴紧无气泡。