高效液相色谱的流动相(Mobile Phase)-阿拉丁试剂
高效液相流动相的选择
高效液相色谱流动相选择之马矢奏春创作流动相 1.流动相的性质要求一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于获得纯品和低毒性等特征.流动相选择1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验,这样可以很快地获得分离结果,然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例.2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量,保管因子约增加3倍,此为三倍规则.这是一个聪慧而又省力的法子.调整的过程中,注意观察各个峰的分离情况. 3：粗调转微调：当分离到达一定水平,应将有机溶剂10%的改变量调整为5%,并据此规则逐渐降低调整率,直至各组分的分离情况不再改变. 选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质.低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质.碱性流动相不能用于硅胶柱系统.酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统. ②纯度.色谱柱的寿命与年夜量流动相通过有关,特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时. ③必需与检测器匹配.使用UV检测器时,所用流动相在检测波长下应没有吸收,或吸收很小.当使用示差折光检测器时,应选择折光系数与样品分歧较年夜的溶剂作流动相,以提高灵敏度. ④粘度要低(应<2cp).高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质,降低柱效,还会使柱压降增加,使分离时间延长.最好选择沸点在100℃以下的流动相. ⑤对样品的溶解度要适宜.如果溶解度欠佳,样品会在柱头沉淀,不单影响了纯化分离,且会使柱子恶化. ⑥样品易于回收.应选用挥发性溶剂.流动相的pH值采纳反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保管,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术.对弱酸,流动相的pH值越小,组分的k值越年夜,当pH 值远远小于弱酸的pKa值时,弱酸主要以分子形式存在;对弱碱,情况相反.分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,经常使用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,经常使用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液.注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象.所以在这种情况下有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂. (三乙胺triethylamine 氨分子中的氢原子被3个乙基取代的产物.分子式(CH3CH2)3N.易挥发的无色液体,有氨的气味.熔点-114.7℃,沸点89.3℃,相对密度0.7275(20/4℃).溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂.三乙胺有碱性,与无机酸能生成易溶于水的盐类.可由N,N- 二乙基乙酰氨与氢化铝锂反应制取,也可用乙醇胺进行气相烷基化反应合成.用于制橡胶硫化增进剂、润湿剂和杀菌剂等,也可用作溶剂和用于合成四级铵化合物.) 如何选择缓冲液PH值在选择缓冲液PH值之前,应先了解被分析物的Pka,高于或低于Pka两个PH值单元的,有助于获得好的、尖锐的峰,从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知,溶液PH值高于或低于Pka两个单元,化合物中99%以一种形式存在,而一种形式存在的化合物才华获得好的尖锐的峰.显示的是它的离子形式和中性化合物的转变,苯甲酸的Pka即是4.2,理论上由HH公示得知,当溶液PH值即是 2.2时,99%的苯甲酸以中性化合物存在,PH值即是6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在,所以当缓冲液PH值即是2.2时,中性化合物以羧酸形式保管于反相柱,表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围.从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值即是2.2. 当化合物只有氨基时,缓冲体系的选择十分简单,年夜大都氨基化合物在PH值小于9时都被质子化,所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用,你也许会问水的PH值年夜约是7,为什么还用缓冲盐,因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性,以及色谱峰的尖锐性,PH值的降低有助于氨基化合物保管的减弱,减小化合物与硅胶概况硅羟基的作用,而使峰更尖锐,从表1 可值,任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析,但我们认为PH值即是3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析. 在上面两个例子中,PH=3的磷酸钾盐都能获得良好的应用,在一般情况下,它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液,而且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好. 流动相的脱气HPLC 所用流动相必需预先脱气,否则容易在系统内逸出气泡,影响泵的工作.气泡还会影响柱的分离效率,影响检测器的灵敏度、基线稳定性,甚至使无法检测.(噪声增年夜,基线不稳,突然跳动).另外,溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相(如烷基胺)反应.溶解气体还会引起溶剂pH的变动,对分离或分析结果带来误差.溶解氧能与某些溶剂(如甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物,此络合物会提高布景吸收(特别是在260nm 以下),并招致检测灵敏度的轻微降低,但更重要的是,会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰(假峰).在荧光检测中,溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象,特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等.在某些情况下,荧光响应可降低达95%.在电化学检测中(特别是还原电化学法),氧的影响更年夜. 除去流动相中的溶解氧将年夜年夜提高UV检测器的性能,也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度.经常使用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等. 对混合溶剂,若采纳抽气或煮沸法,则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变动. 超声脱气比力好,10~20分钟的超声处置对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了(一般500ml溶液需超声20~30min方可),此法不影响溶剂组成.超声时应注意防止溶剂瓶与超声槽底部或壁接触,以免玻璃瓶破裂,容器内液面不要高出水面太多. 离线(系统外)脱气法不能维持溶剂的脱气状态,在你停止脱气后,气体立即开始回到溶剂中.在1~4小时内,溶剂又将被环境气体所饱和. 在线(系统内)脱气法无此缺点.最经常使用的在线脱气法为鼓泡,即在色谱把持前和进行时,将惰性气体喷入溶剂中.严格来说,此方法不能将溶剂脱气,它只是用一种低溶解度的惰性气体(通常是氦)将空气替换出来.另外还有在线脱气机. 一般说来有机溶剂中的气体易脱除,而水溶液中的气体较顽固.在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法,这种连续脱气法在电化学检测时经常使用.但氦气昂贵,难于普及. 流动相的滤过所有溶剂使用前都必需经0.45µm(或0.22µm)滤过,以除去杂质微粒,色谱纯试剂也不例外(除非在标签上标明“已滤过”).用滤膜过滤时,特别要注意分清有机相(脂溶性)滤膜和水相(水溶性)滤膜.有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂,过滤水溶液时流速低或滤不动.水相滤膜只能用于过滤水溶液,严禁用于有机溶剂,否则滤膜会被溶解!溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC.对混合流动相,可在混合前分别滤过,如需混合后滤过,首选有机相滤膜.现在已有混合型滤膜出售.流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中.因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料概况的增塑剂,招致溶剂受污染.这种被污染的溶剂如用于HPLC 系统,可能造成柱效降低.贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成变动,也防止氧和二氧化碳溶入流动相. 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉,应尽量新鲜配制使用,不要贮存.如确需贮存,可在冰箱内冷藏,并在3天内使用,用前应重新滤过.容器应按期清洗,特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子,以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物.因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子无此现象. 卤代有机溶剂应特别注意的问题卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质,能与HPLC系统中的不锈钢反应.卤代溶剂与水的混合物比力容易分解,不能寄存太久.卤代溶剂(如CCl4、CHCl3 等)与各种醚类(如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等)混合后,可能会反应生成一些对不锈钢有较年夜腐蚀性的产物,这种混合流动相应尽量不采纳,或新鲜配制.另外,卤代溶剂(如CH2Cl2)与一些反应性有机溶剂(如乙腈)混合静置时,还会发生结晶.总之,卤代溶剂最好新鲜配制使用.如果是和干燥的饱和烷烃混合,则不会发生类似问题.。
阿拉丁(aladdin)LC-MS溶剂中文版目录
LC-MS 级溶剂1/2LC-MS 级溶剂LC-MS 级溶剂有着灵敏度更高的、使用更便捷的高效液相色谱质谱联用仪器（LC-MS）的问世，LC-MS 迅速地成为制药、生物化工、化学合成、环境保护和食品科学等领域的一种首选的分析工具。
提供一种绝对无杂质干扰的LC-MS 级溶剂，可确保LC-MS 分析达到最优化的条件和最优化的特性，同时可保证LC-MS 分析仪器和色谱柱有更长的的使用寿命。
阿拉丁的LC-MS 溶剂是是阿拉丁为拓展LC-MS 的应用而精心开发的最高级别的溶剂产品。
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阿拉丁LC-MS 溶剂是经过特别加工精制的溶剂，满足现代LC-MS 仪的需要，具有非常低的有机物杂质、金属杂质和微粒，具有极低的背景吸收，是您在使用LC-MS 和HPLC 时的最理想选择。
特点•低挥发物残留•低背景•低杂质•批次稳定性•低UV 吸收•低离子含量•通过梯度洗脱检测•经0.2µm 膜过滤•惰性气体封装应用适合≤ppb 级高灵敏度LC-MS 分析和其他需要极低污染和化学噪音的应用.LC-MS 级溶剂适合≤ppb 级高灵敏度LC-MS 分析和其他需要极低污染和化学噪音的应用.货号 品名 规格 CAS 包装2/2LC-MS 级溶剂A120771乙腈Acetonitrile LC-MS 75-05-81L, 6×1L 2.5L, 4×2.5L W119425水Water LC-MS 7732-18-51L4L ,4×4L M116125甲醇MethanolLC-MS 67-56-11L4L , 4×4L I112019异丙醇Isopropyl Alcohol LC-MS 67-63-01L 2.5L E116141乙酸乙酯Ethylacetate LC-MS 141-78-61L 2.5L H120773正己烷n-Hexane LC-MS 110-54-31L 2.5L H120772正庚烷HeptaneLC-MS142-82-51L 2.5LT103297三氟乙酸Trifluoroacetic acid LC-MS 76-05-110ml 1L F112037甲酸 Formate LC-MS 64-18-625ml 100ml A116168乙酸 AcetateLC-MS 64-19-7100mL 500mL A100186甲酸铵Ammonium formate LC-MS 540-69-250G A112060乙酸铵Ammonium acetate LC-MS 631-61-825G 100G A11208425%氨水溶液Ammonia solution LC-MS 1336-21-6100mL T103290三乙胺TriethylamineLC-MS121-44-850mL货号 品名 规格 CAS 包装LC-MS 流动相添加剂。
第四节 高效液相色谱固定相和流动相
平均孔径 相对分子质量
（Å）
排斥极限
102
700
103
（0.1~20)×104
104
（1~20）×104
105
（1~20）×105
106 （5~大于10）×106
硅胶
125
(0.2~5)×104
300
（0.03~1)×105
10
500
（0.05~5)×105
1000
（5~20)×105
液相色谱流动相
• 化学键合固定相：广泛使用
化学键合固定相
以硅珠为基质，将有机物基团固定在担体上。可分为： 硅氧碳键型(≡ Si－O－C ): 硅氧硅碳键型(≡Si－O－Si－C) 硅碳键型(≡Si－C): 硅氮键型(≡Si－N):
优点：1）表面均一；2）选择性多；3）柱效高；4）色谱柱稳定性 好；5）耐各种溶剂。
0.00
7.1
0.01
7.3
0.18
8.6
0.32
9.2
0.40
9.1
0.42
9.6
0.45
9.1
0.56
9.4
0.65
11.8
0.95
12.9
最大
21
最佳H值/mm
0.2-0.4
0.01-0.03
柱长/cm
50-100
10-25
柱内径
2
2-5
柱压
小
大
样品容量（mg/g）
0.05-0.1
1-5
比表面积（m2/g）
10-25
400-600
2. 液液色谱固定相
• 涂渍型固定相：将固定液（β, β-一氧二丙腈、聚 乙二醇、角鲨烷）等涂渍在担体（硅珠）上。稳 定性不好，现已很少使用。
高效液相色谱仪流动相配置操作规程
高效液相色谱仪流动相配制标准操作规程1.目的明确高效液相色谱法流动相配制过程，保证操作过程的规范性。
2.适用范围适用于实验室高效液相色谱法流动相配制。
3.职责实验室分析人员负责按本规程进行操作.4. 内容4.1流动相批号的编写原则:流动相批号按配制日期编制，如批号20150609，代表2015年06月09日配制。
4.2流动相配制4。
2.1含水流动相和不含水流动相的配制所用量筒应区分开，配制不含水的有机溶剂类流动相所用量筒必须是干燥状态，不得有水.4.2.2根据样品分析方法所规定的流动相体积比例配制,在清洁的带塞量筒中分别倒入相应的溶剂，若该流动相需加入适量的酸或碱，则戴上一次性手套，用专用注射器吸取规定体积的酸或碱，加入量筒，盖上塞子摇匀,振动过程应主要排气。
4.2.3含盐的缓冲液类流动相的配制应根据规定比例配制，分别秤取规定重量的盐于清洁的带塞量筒中，加入适量纯水,振摇，待固体完全溶解后，再加纯水至规定刻度，盖上塞子，摇匀。
4.2。
4若该流动相对PH值有特殊要求,根据流动相配制规定的体积比例,用酸或碱调节PH值，用PH计测定直至规定范围内。
4。
3流动相抽滤4.3。
1含水流动相和不含水流动相的抽滤装置应区分，抽滤不含水的有机溶剂类流动相所用装置必须是干燥无水的。
4。
3.2抽滤装置准备：将过滤器套在三角烧瓶上，用镊子夹取0.45μm的水系或有机滤膜一张，放在砂芯过滤器上(注意：滤膜应将过滤面完全覆盖)；再将量杯压在滤膜上，量杯边缘和过滤器的边缘对齐；用配套的夹子将过滤器和量杯接头边缘固定（注意夹子位置应避开抽滤嘴）；将抽滤软管套在抽滤嘴上。
4.3.3抽滤:将少量配置好的流动相倒入量杯内,观察是否有漏液现象，若出现漏液须重新固定过滤器和量杯。
如未漏液则继续倒入流动相（注意不要超过量杯最大刻度线），开启真空泵抽滤。
抽滤结束先拔掉与抽滤嘴连接的真空软管,再关闭真空泵。
4。
3.4脱气：将抽滤好的流动相转入流动相试剂瓶内（少量润洗一次倒入废液桶内再盛装）,盖上瓶盖(瓶盖不得拧紧），常温下超声波超声15至20分钟.4。
高效液相色谱法测定着色剂食品黄3中6种磺酸类杂质
化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE第30卷，第2期2021年2月V ol. 30，No. 2Feb. 20216doi ：10.3969／j.issn.1008–6145.2021.02.002高效液相色谱法测定着色剂食品黄3中6种磺酸类杂质梁文耀1，李鑫宇1，李焯原1，王珍玉2，汪毅1，聂明霞1，谭建华1（1.广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量监督检验中心，广州 511447； 2.广东工业大学，广州 510006）摘要 建立了高效液相色谱法测定着色剂食品黄3中6种磺酸类杂质的分析方法。
采用纯水超声提取样品，以乙腈–四丁基溴化铵水溶液为流动相，经Agilent ZORBAX SB–C 18（4.6 mm ×250 mm ，5 μm ）色谱柱分离后，用二极管阵列检测器（DAD ）进行检测。
以保留时间和紫外吸收光谱定性，外标法定量。
6种磺酸类杂质在相应的质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数（r 2）均大于0.999，检出限为0.01～0.15 mg ／L ，定量限为0.03～0.50 mg ／L ，平均加标回收率为94.3%～99.3%，相对标准偏差为0.85%～3.95%（n =6）。
该方法快速、高效、准确，适用于食品黄3中6种磺酸类杂质的测定。
关键词 磺酸类杂质；着色剂；食品黄3；高效液相色谱法中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008–6145(2021)02–0006–05Determination of 6 sulfonic acid impurities in colorants food yellow 3by high performance liquid chromatographyLiang Wenyao 1， Li Xinyu 1， Li Zhuoyuan 1， Wang Zhenyu 2， Wang Yi 1， Nie Mingxia 1， Tan Jianhua 1(1. National Quality Supervision and Testing Center for Cosmetics, Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute ， Guangzhou 511447, China; 2. Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)Abstract A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the simultaneous determination of 6 sulfonic acid impurities in colorants food yellow 3. The samples were extracted with pure water, then separated on an Agilent ZORBAX SB–C 18 (4.6 mm ×250 mm, 5 μm) column utilizing a mobile phase of acetonitrile–tetrabutylammonium bromide aqueous solution and detected by DAD. The qualitative analysis was based on retention time and ultraviolet absorbance, while quantitative analysis was performed by the external standard method. The test showed that there was a good linear relationship between 6 sulfonic acid impurities and the chromatographicpeak areas in the corresponding concentration range, with their correlation coefficients (r 2) all more than 0.999. The limits of detection and limits of quantitation of the method were in the ranges of 0.01–0.15 mg ／L and 0.03–0.50 mg ／L, respectively. The average recoveries were 94.3%–99.3% with the relative standard deviations of 0.85%–3.95% （n =6）. The method is fast, efficient, accurate, and it could be applied for the simultaneous determination of six sulfonic acid impurities in food yellow 3.Keywords sulfonic acid impurities; cosmetics colorants; food yellow 3; high performance liquid chromatography食品黄3(CI 15985)，又名日落黄(Sunsetyellow)，化学名称为1-(对磺苯基偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二钠盐［1］。
色谱应用耗材
色谱应用耗材色谱是一种常用的分析技术，用于分离和检测混合物中的化合物。
在色谱分析中，会使用各种耗材和设备来实现样品的分离和检测。
以下是一些常见的色谱应用耗材：1.色谱柱（Chromatography Columns）：色谱柱是色谱分离的关键组件，根据不同的色谱技术有不同的类型，例如气相色谱（GC）柱、液相色谱（HPLC）柱、离子色谱（IC）柱等。
2.注射器（Injectors）：在液相色谱和气相色谱中，用于将样品引入色谱系统的注射器，确保样品在色谱柱中得到适当的分离。
3.流动相（Mobile Phase）：在液相色谱中，流动相是指用于在色谱柱中移动样品的液体混合物，可以是单一溶剂或是多种溶剂的混合物。
4.固定相（Stationary Phase）：在液相色谱中，固定相是指涂覆在色谱柱内壁的物质，通过与流动相中的样品发生相互作用，实现样品分离。
5.柱后装置（Post-column Devices）：用于进一步分析和检测色谱分离后的物质，例如检测器、质谱仪等。
6.样品瓶和样品容器：用于储存和保存待测样品的瓶子、容器等。
7.进样瓶和进样针（Vials and Syringes）：用于将待测样品装入样品瓶中，并使用进样针将样品引入色谱系统。
8.色谱标准品和内标物质：用于定量分析的标准物质，可以用于校准仪器或用作定量参照。
9.滤膜和过滤器：用于处理样品，去除杂质或固体颗粒，以确保样品的纯净性。
10.色谱软件：用于控制和分析色谱数据的计算机软件，提供数据处理和报告功能。
以上是色谱应用中常见的一些耗材，具体使用的耗材会根据不同的色谱技术和实验需求而有所不同。
在进行色谱分析时，选择合适的耗材和设备对于获得准确可靠的分析结果至关重要。
高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料、养殖用水中五氯酚的残留
中国畜牧兽医 2024,51(4):1438-1447C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留朱季升1,2,邢维海2,李 政3,王 力3,张亚伟1,张元庆1,杨 丹4,杨悠悠2(1.山西农业大学动物科学学院,晋中030801;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;3.中粮家佳康食品有限公司,北京100020;4.国贸食品科学研究院有限公司,北京102209)摘 要:ʌ目的ɔ本试验旨在建立一种测定猪饲料㊁饲料添加剂㊁水等养殖环节投入品中五氯酚残留的高效液相色谱-三重四极杆质谱方法㊂ʌ方法ɔ待测样品经碱性甲醇水溶液提取,使用阴离子固相萃取柱富集净化,经氮吹浓缩后用2%甲酸甲醇复溶,以5m m o l /L 乙酸铵溶液-甲醇为流动相,经P o r o s h e l l 120E C -C 18(3m mˑ100m m ,2.7μm )色谱柱分离;负离子模式下,采用多反应监测模式(m u l t i p l e r e a c t i o nm o n i t o r i n g ,M R M )进行检测;使用基质匹配外标法测定五氯酚的含量,并对所建方法的线性关系㊁检测限(l i m i to fd e t e c t i o n ,L O D )㊁定量限(l i m i to fqu a n t i t a t i o n ,L O Q )㊁回收率㊁准确度㊁精密度㊁基质效应等指标进行考察㊂ʌ结果ɔ猪饲料和饲料添加剂中五氯酚的检测限和定量限分别为0.1和0.5μg /k g ,养殖用水中五氯酚的检测限和定量限分别为5和12.5n g /L ;饲料和饲料添加剂中五氯酚定量范围为0.5~20μg /k g ,养殖用水中五氯酚定量范围为12.5~500n g /L ,方法线性关系良好,相关系数(R 2)均>0.999㊂该方法在饲料和饲料添加剂以及养殖用水中的平均加标回收率为69.8%~119.5%,相对标准偏差(r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ,R S D )为1.62%~9.86%,基质效应(m a t r i xe f f e c t ,M E )为0.62~1.29㊂ʌ结论ɔ本试验所建方法简便㊁快捷㊁灵敏度高㊁重复性好,适用于猪配合饲料等养殖投入品中五氯酚的测定,可为养殖环节投入品中五氯酚污染筛查提供准确高效的技术手段,从源头保障动物源性产品安全㊂关键词:五氯酚;饲料;固相萃取;高效液相色谱-三重四极杆质谱中图分类号:S 816文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.012 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-30基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y 2023P T 14);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2022-YW F -Z Y S Q -09);北京市科技计划课题(Z 221100007122006)联系方式:朱季升,E -m a i l :z h u j i s h e n g 2022@163.c o m ㊂通信作者张元庆,E -m a i l :y u a n q i n g _z h a n g @163.c o m ;杨丹,E -m a i l :y a n g_d a n @c o f c o .c o m ;杨悠悠,E -m a i l :y a n g y o u 229@126.c o m D e t e r m i n a t i o no f P e n t a c h l o r o ph e n o lR e s i d u e s i nS w i n eF o r m u l aF e e d a n dF a r m W a t e r U s i n g H i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y -t r i p l e Q u a d r u p o l eM a s s S p e c t r o m e t r yZ HUJ i s h e n g 1,2,X I N G W e i h a i 2,L I Z h e n g 3,WA N GL i 3,Z H A N G Y a w e i 1,Z HA N G Y u a n q i n g 1,Y A N G D a n 4,Y A N G Y o u yo u 2(1.C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e ,S h a n x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,J i n z h o n g 030801,C h i n a ;2.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lN u t r i t i o n ,I n s t i t u t e o f A n i m a l S c i e n c e o f C A A S ,B e i j i n g100193,C h i n a ;3.C O F C OJ i a k a n g F o o dC o .,L t d .,B e i j i n g 100020,C h i n a ;4.C h i n a I n t e r n a t i o n a l T r a d eF o o dS c i e n c eR e s e a r c h I n s t i t u t eC o .,L t d .,B e i j i n g 102209,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔA h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y -t r i p l e q u a d r u po l e m a s s s p e c t r o m e t r y (H P L C -M S /M S )m e t h o dw a s d e v e l o p e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p e n t a c h l o r o p h e n o l (P C P )i ns w i n ef e e d ,f e e da d d i t i v e sa n d w a t e r .ʌM e t h o d ɔT h es a m pl e s w e r ee x t r a c t e d w i t h a q u e o u sa l k a l i n e m e t h a n o l i cs o l u t i o n ,e n r i c h e d a n d c l e a n e d u p u s i n g an a n i o n i cs o l i d p h a s e4期朱季升等:高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留e x t r a c t i o n c o l u m n,r e c o n s t i t u t e dw i t h2%f o r m a t em e t h a n o l a f t e r n i t r og e n d r y i n g.W i t h5m m o l/La m m o n i u ma c e t a t e s o l u t i o n-m e t h a n o l a sm ob i l e p h a s e,P o r o s h e l l120E C-C18(3m mˑ100m m,2.7μm)c o l u m n w a su s e dt os e p a r a t e P C P.U n d e rt h en e g a t i v ei o n i z a t i o n,m u l t i p l er e a c t i o n m o n i t o r i n g m o d e(M R M)w a su s e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to fP C P.M a t r i x-m a t c h e de x t e r n a l q u a n t i f i c a t i o n m e t h o d w a su t i l i z e dt o q u a n t i t a t e P C P.L i n e a rr e l a t i o n s h i p,l i m i t so fd e t e c t i o n (L O D),l i m i t so f q u a n t i f i c a t i o n(L O Q),r e c o v e r y,a c c u r a c y,p r e c i s i o n,m a t r i xe f f e c ta n do t h e ri n d i c a t o r s o f t h e e s t a b l i s h e dm e t h o dw e r e i n v e s t i g a t e d.ʌR e s u l tɔT h eL O Da n dL O Q w e r e0.1a n d0.5μg/k g i n l i v e s t o c kf e e d,f e e d i n g r e d i e n t sa n df e e da d d i t i v e s,w h i l e5a n d12.5n g/Li nf a r m w a t e r,r e s p e c t i v e l y.T h e l i n e a r r a n g eo fP C P i n l i v e s t o c k f e e d,f e e d i n g r e d i e n t s a n d f e e da d d i t i v e s w a s f r o m0.5t o20μg/k g,a n d t h e l i n e a r r a n g eo f f a r m w a t e rw a s f r o m12.5t o500n g/L.T h e l i n e a r c o e f f i c i e n t(R2)w a sm o r e t h a n0.999,s h o w i n g t h e g o o d l i n e a r i t y.I n a d d i t i o n,t h e r e c o v e r i e s r a n g e d f r o m69.8%t o119.5%a n d t h e r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n(R S D)w e r e f r o m1.62%t o9.86%. T h em a t r i xe f f e c t(M E)w a s0.62-1.29.ʌC o n c l u s i o nɔT h em e t h o de s t a b l i s h e d i n t h i s s t u d y w i t h h i g hs e n s i t i v i t y,h i g ha c c u r a c y a n d g o o d r o b u s t n e s sw a s s u i t a b l e f o r t h e s c r e e n i n g o f P C P i n s w i n e f o r m u l a f e e d a n do t h e r f a r m i n g i n p u t s t o e n s u r e t h e q u a l i t y a n d s a f e t y o fm e a t p r o d u c t s.K e y w o r d s:p e n t a c h l o r o p h e n o l;f e e d;s o l i d p h a s e e x t r a c t i o n;H P L C-M S/M S五氯酚(p e n t a c h l o r o p h e n o l,P C P)是一种有机氯农药,在杀虫㊁除草㊁杀菌㊁木材防腐等方面效果良好[1],其化学性质稳定,难以降解,可溶于甲醇㊁乙腈等有机溶剂,微溶于水;五氯酚分子结构中含有酚羟基,极性较强,在碱性条件下可转化为五氯酚酸盐,自然环境中多以五氯酚酸钠的形式存在,具有良好的水溶性(图1)㊂在20世纪,五氯酚及其钠盐曾被广泛用于养殖水体消毒和血吸虫病防治[2],在发挥其功效的同时对环境造成了严重污染[3]㊂五氯酚在生物体内蓄积可引起氧化磷酸化途径解偶联,造成能量代谢障碍[4],长期暴露有致畸㊁致癌㊁致突变等毒副作用,严重时会导致生物体的死亡㊂当前在水生动物[5-6]㊁畜禽动物[7]㊁人体血液[8]㊁尿液[9-10]等组织中皆有检出案例,说明五氯酚已经进入食物链[11],并且通过生物富集作用严重威胁到了人类的生命安全㊂因五氯酚具有生物毒性㊁难以降解㊁易生物富集等特点,国际上将其认定为持久性有机污染物(P O P s)[12],世界卫生组织也将其列为一类致癌物;2019年底,中国农业农村部发布第250号公告明确规定,五氯酚在动物性食品中不得检出㊂但近年来在畜禽产品中检出五氯酚的情况仍屡有报道,据市场监督管理总局统计结果,2020年1月 2021年11月期间,在猪肉中共检出43次㊁牛肉中18次㊁羊肉中12次[13],禽肉中2次[14]㊂究其原因主要来源于畜禽养殖生产过程中的饲料及水污染[15-16],目前有关饲料和水等养殖投入品中五氯酚的检测方法存在灵敏度低㊁操作繁复等问题[17-18],因此,亟需建立一种更加简便快捷㊁灵敏度高㊁准确性高的饲料等养殖投入品中五氯酚的检测方法,从源头保障动物源性产品安全㊂图1五氯酚及五氯酚酸钠化学结构图F i g.1C h e m i c a l s t r u c t u r eo f p e n t a c h l o r o p h e n o la n ds o d i u m p e n t a c h l o r o p h e n o l a t e由于饲料等养殖投入品中含有较多的蛋白质㊁脂肪㊁色素等物质,会严重影响分析结果的准确性,并极易污染检测设备,因此需寻求合适的样品前处理方法㊂目前,五氯酚测定的前处理方法主要有液液萃取法(L L E)[19]㊁加速溶剂萃取法(A S E)[20]㊁Q u E C h E R S[21]㊁固相萃取法(S P E)[22-23]㊁固相微萃取法(S P M E)[24-25]㊁分子印迹法(M I T)[26-27]等,其中S P E法是通过选择性吸附或选择性洗脱,实现目标化合物与基质中干扰物质的分离方法,可显著降低基质效应㊂固相萃取柱的选择需要综合考虑目标化合物的性质与基质的种类㊂分析检测的方法主要是色谱法和质谱法,常用的分析仪器有液相色谱仪(L C)[22]㊁气相色谱仪(G C)[28]㊁液相色谱-质谱联用仪(L C-M S)[29]㊁气相9341中国畜牧兽医51卷色谱-质谱联用仪(G C-M S)[30-31]㊂其中L C和G C 法仅通过保留时间定性,存在灵敏度低,易存在假阳性的情况,且由于五氯酚强极性㊁高沸点等特点,在使用G C和G C-M S时,需进行衍生化反应,操作复杂耗时,因此,液相色谱-串联质谱联用仪在五氯酚精准检测方面具有较明显优势㊂本研究为重点考察养殖环节是否存在五氯酚酸钠污染的风险,拟建立一种基于固相萃取法等样品前处理方法,结合高效液相色谱-三重四极杆质谱(H P L C-M S/M S)的猪配合饲料㊁添加剂等养殖投入品中五氯酚的分析方法,以期为生猪养殖过程中的五氯酚污染筛查提供参考和依据㊂1材料与方法1.1样品采集2023年3月-2023年5月,依照‘饲料采样“(G B/T14699.1-2005)和‘水质采样技术指导“(H J494-2009)从北京周边养殖场采集了具有代表性的33种各阶段猪配合饲料㊁22种饲料原料㊁49种饲料添加剂和22份水样,样品种类信息见表1㊂空白猪配合饲料㊁饲料添加剂㊁养殖用水样品均由国贸食品科学研究院有限公司提供,经方法验证后均为五氯酚阴性㊂表1样品信息T a b l e1S a m p l e i n f o r m a t i o n样品S a m p l e s种类T y p e s数量N u m b e r 猪配合饲料仔猪配合饲料9S w i n e f o r m u l a f e e d中猪配合饲料4大猪配合饲料5生长育肥猪配合饲料8妊娠母猪配合饲料2哺乳母猪配合饲料3后备母猪配合饲料2饲料原料鱼粉2F e e d i n g r e d i e n t玉米2碎米3小麦麸2亚麻籽1膨化大豆1菜籽粕2豆粕4续表样品S a m p l e s种类T y p e s数量N u m b e r小麦次粉3小麦1大麦壳1饲料添加剂氨基酸㊁氨基酸盐及其类似物17 F e e da d d i t i v e矿物元素及其络(螯)合物9维生素及类维生素8防腐剂㊁防霉剂和酸度调节剂5抗氧化剂2酶制剂5微生物3养殖用水饲用水15 F a r m w a t e r清洁用水4污水3 1.2主要试剂五氯酚标准品(纯度>98.9%),购自D r.E h r e n s t o r f e r公司;乙腈㊁甲醇(色谱纯)㊁乙酸铵(质谱纯)均购自T h e r m oF i s h e r公司;25%氨水㊁甲酸㊁三乙胺(色谱纯)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;试验用水为经M i l l i-Q处理后的一级水(>18.2MΩ)㊂1.3主要仪器高效液相色谱-质谱联用仪(6470T r i p l eQ u a d L C/M S,安捷伦科技有限公司);数控超声波清洗器(K Q-500D E,昆山市超声仪器有限公司);小型高速冷冻离心机(5810R,艾本德股份公司);涡旋混合器(V O R T E X-5,其林贝尔仪器制造有限公司);分析天平(J A3003,上海力辰仪器科技有限公司);隔膜真空泵(GM-0.33A,天津津腾实验设备有限公司);小型粉碎机(S M-3L,台湾祥泰精机股份有限公司);超纯水制备仪(M i l l i-Q A d v a n t a g eA10,默克密理博公司);MA X固相萃取小柱(60m g/3m L,北京康普兴科技有限公司)㊂1.4色谱与质谱条件1.4.1色谱条件使用A g i l e n tP o r o s h e l l120E C-C18(3m mˑ100m m,2.7μm)色谱柱;柱温40ħ;进样量为5μL;流速:0.3m L/m i n;流动相A 相为5m m o l/L乙酸铵水溶液,B相为甲醇,梯度洗脱方法见表2㊂04414期朱季升等:高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留表2梯度洗脱条件T a b l e2M o b i l e p h a s e g r a d i e n t e l u t i o nm e t h o d s时间T i m e/m i n流动相M o b i l e p h a s e/%A B 06040 16040 5595 85951.4.2 质谱条件采用喷射流电喷雾离子源(A J SE S I),负离子模式;毛细管电压-3500V;喷嘴电压-500V;雾化气温度300ħ,雾化气流速12L/m i n,雾化器压力40p s i;鞘气温度350ħ,鞘气流速10L/m i n;采用多反应监测模式(M R M)进行离子监测,其余质谱参数见表3㊂表3五氯酚M R M监测参数T a b l e3P e n t a c h l o r o p h e n o lM R M m o n i t o r i n gp a r a m e t e r s前体离子P r e c u r s o r i o n/(m/z)产物离子P r o d u c t i o n/(m/z)驻留时间D w e l l/m s碎裂电压F r a g m e n t o r/V碰撞池加速电压C e l l a c c e l e r a t o r v o l t a g e/V 262.7262.71001354 264.7*264.7*1001354 266.7266.71001354 268.7268.71001354*,定量离子对*,Q u a n t i t a t i v e i o n p a i r s1.5样品前处理1.5.1饲料及饲料原料样品前处理样品粉碎后称取2.00g置于离心管中,加入6m L含5%三乙胺的甲醇水(V/V为7ʒ3)溶液,涡旋混匀1m i n,超声提取5m i n,3000r/m i n离心5m i n,收集上清液,重复上述步骤1次,合并两次所得上清液㊂将上清液移入经5m L甲醇㊁5m L水活化后的MA X固相萃取小柱,自然流出,然后依次加入5m L5%氨水㊁5m L甲醇㊁5m L2%甲酸甲醇水(V/V为1ʒ1)淋洗,抽干萃取柱5m i n后使用4m L8%甲酸甲醇洗脱,收集洗脱液,氮吹浓缩至近干,加入2m L2%甲酸甲醇溶液涡旋混匀,过0.22μm有机相滤膜后,供检测分析㊂1.5.2水样前处理量取40m L水样于离心管中,加入10m L25%氨水,涡旋混匀1m i n,移入经5m L甲醇㊁5m L水活化后的MA X固相萃取小柱,自然流出,然后依次加入5m L甲醇㊁5m L2%甲酸甲醇水淋洗,后续步骤同饲料及饲料原料样品前处理㊂1.5.3饲料添加剂样品前处理称取2.00g样品,置于离心管中,加入6m L含5%三乙胺的甲醇水溶液,涡旋混匀1m i n,超声提取5m i n,3000r/m i n 离心5m i n,收集上清液,重复上述步骤1次,合并两次所得上清液,氮吹至近干,后续步骤同饲料及饲料原料样品前处理㊂1.6溶液制备1.6.1标准溶液制备准确称取1m g五氯酚标准品,使用100m L甲醇溶解配为10m g/L的五氯酚标准储备溶液,于-20ħ保存备用㊂1.6.2空白基质溶液制备取空白猪配合饲料㊁饲料添加剂㊁养殖用水样品,经1.5所述样品前处理方法处理后,制为空白基质溶液,于-20ħ保存备用㊂1.7方法学验证1.7.1线性关系标准溶液经甲醇梯度稀释后,配制成浓度为5㊁12.5㊁25㊁50㊁100㊁200㊁500㊁1000μg/L的标准工作液,准确移取1.6.2所制空白基质溶液(980μL)和20μL不同浓度的标准工作液,涡旋混匀,配制不同浓度的基质匹配标准溶液(表4),上机检测后,以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制基质匹配标准曲线㊂1441中国畜牧兽医51卷表4各基质匹配标准溶液中五氯酚折算后浓度T a b l e4T h e c o n v e r t e d c o n c e n t r a t i o no f p e n t a c h l o r o p h e n o l i n t h e s t a n d a r d s o l u t i o nm a t c h e db y e a c hm a t r i x基质M a t r i c e s浓度C o n c e n t r a t i o n饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n g r e d i e n t s/(μg/k g)0.10.5151020饲料添加剂F e e da d d i t i v e s/(μg/k g)0.10.5151020养殖用水F a r m w a t e r/(n g/L)512.5501002005001.7.2检测限和定量限取所制各基质匹配标准溶液,经仪器检测后,以五氯酚定量离子色谱信号信噪比(S/N)ȡ3作为检测限(l i m i to fd e t e c t i o n, L O D),以S/Nȡ10作为定量限(l i m i t o f q u a n t i t a t i o n,L O Q)㊂1.7.3准确度与精密度以加标回收试验验证方法的准确度与精密度,空白猪配合饲料㊁饲料添加剂㊁养殖用水样品各称取6份,通过添加五氯酚标准储备溶液制为低㊁中㊁高3水平的加标样品,按照1.5样品前处理方法处理后检测分析,每个添加水平重复测定6次,计算回收率及相对标准偏差(r e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n,R S D,%),考察方法的准确度及精密度㊂1.7.4基质效应绘制甲醇溶剂标准曲线(斜率为K2)和各基质匹配标准曲线(斜率为K1),定义基质因子(m a t r i x f a c t o r,M F)=K1/K2[32]㊂2结果2.1方法线性关系按1.7.1所述方法绘制基质匹配标准曲线,测定结果表明,不同基质中五氯酚的质量浓度与对应的峰面积在定量范围内线性关系良好,饲料与饲料原料㊁饲料添加剂㊁水的基质匹配标准曲线相关系数(R2)分别为0.9997㊁0.9994㊁0.9992;饲料与饲料原料㊁饲料添加剂基质中五氯酚线性范围为0.5~ 20μg/k g,养殖用水基质中五氯酚线性范围为12.5~500n g/L(表5)㊂表5不同基质中五氯酚的线性方程㊁相关系数㊁线性范围T a b l e5L i n e a r e q u a t i o n s,c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s,l i n e a r r a n g e s o f p e n t a c h l o r o p h e n o l i nd i f f e r e n tm a t r i c e s基质M a t r i c e s线性方程L i n e a r e q u a t i o n相关系数R2线性范围L i n e a r i t y r a n g e 饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n g r e d i e n t s Y=1639.87X+351.750.99970.5~20μg/k g 饲料添加剂F e e da d d i t i v e s Y=3415.14X+1668.320.99940.5~20μg/k g 养殖用水F a r m w a t e r Y=62.96X+173.980.999212.5~500n g/L Y为峰面积,X为折算后样品中五氯酚浓度Yi s t h e p e a ka r e a,a n dXi s t h e c o n c e n t r a t i o no f p e n t a c h l o r o p h e n o l i n t h e c o n v e r t e d s a m p l e2.2方法检测限㊁定量限㊁基质效应饲料与饲料原料㊁饲料添加剂㊁水中五氯酚的L O D分别为0.1μg/k g㊁0.1μg/k g㊁5n g/L,L O Q 分别为0.5μg/k g㊁0.5μg/k g㊁12.5n g/L㊂绘制饲料与饲料原料㊁饲料添加剂㊁养殖用水的基质匹配标准曲线,与甲醇溶剂标准曲线进行比较,测得M F分别为0.62㊁1.29㊁1.19(表6)㊂表6不同基质中五氯酚的检测限㊁定量限㊁基质效应因子T a b l e6L O D,L O Q a n dM Fo f p e n t a c h l o r o p h e n o l i nd i f f e r e n tm a t r i c e s基质M a t r i c e s检测限L O D定量限L O Q基质因子M F 饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n g r e d i e n t s0.1μg/k g0.5μg/k g0.62饲料添加剂F e e da d d i t i v e s0.1μg/k g0.5μg/k g1.29养殖用水F a r m w a t e r5n g/L12.5n g/L1.19 24414期朱季升等:高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留2.3 方法准确度与精密度由表7可知,饲料与饲料原料中五氯酚的回收率为69.80%~93.76%,R S D 为4.31%~9.86%,饲料添加剂中五氯酚回收率为73.16%~96.32%,R S D 为0.89%~5.16%,水中五氯酚的回收率为76.89%~119.50%,R S D 为1.62%~7.23%㊂样品测定准确度与精密度均良好㊂表7 不同基质中五氯酚加标回收率及精密度T a b l e 7 S p i k e d r e c o v e r i e s a n d p r e c i s i o no f p e n t a c h l o r o p h e n o l i nd i f f e r e n tm a t r i c e s 基质M a t r i c e s 加标量S p i k i n g l e v e l 回收率R e c o v e r y /%相对标准偏差R S D/%饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n gr e d i e n t s 0.5μg /k g 69.804.312μg /k g 93.769.8610μg /k g 76.505.89饲料添加剂F e e da d d i t i v e s0.5μg /k g73.165.162μg /k g 77.230.8910μg /k g 96.321.21养殖用水F a r m w a t e r12.5n g/L 76.897.2325n g /L 119.502.7150n g /L 111.281.622.4 实际样品检测使用本研究所建方法对33种猪配合饲料㊁22种饲料原料㊁49种饲料添加剂以及22种养殖用水样品进行分析,其中2种饲料样品中检出了五氯酚,但低于方法定量限,2种饲料添加剂中检出了五氯酚,含量分别为1.8和15.5μg/k ,阳性样品中五氯酚的多反应监测图见图2㊂图2 阳性样品中五氯酚的M R M 监测图F i g .2 M R M m o n i t o r i n g c h r o m a t o g r a mo f p e n t a c h l o r o p h e n o l i n p o s i t i v e s a m pl e s 3 讨 论3.1 前处理条件的优化五氯酚为弱酸性化合物,pK a 为4.73,目前复杂基质中五氯酚的提取主要为酸提取[33]和碱提取[34]两种方式,酸提取是通过调节p H 使五氯酚以酚羟基形式存在,较易溶于有机试剂,碱提取是在碱性条件下,五氯酚的酚羟基发生解离形成阴离子,而易溶于水中㊂MA X 固相萃取柱为混合型阴离子交换柱,在碱性环境中,五氯酚可与MA X 柱填料上的季铵基发生离子交换作用而被保留,可适用于饲料提取液及养殖用水中五氯酚的富集净化㊂本研究所使用的色谱柱p H 耐受范围为2.0~9.0,饲料添加剂的提取液㊁饲料及水样的洗脱液,p H 均超过色谱柱的耐受范围,无法直接检测,需氮吹浓缩复溶处3441中国畜牧兽医51卷理㊂为使五氯酚在色谱柱中良好保留,并考虑色谱柱的p H耐受范围,经试验对比,选用2%甲酸甲醇作为复溶试剂,可获得理想的色谱峰形㊂目前水中五氯酚的检测常使用C18[35]㊁H L B等反相固相萃取柱,而MA X固相萃取柱的应用较少,李丽等[36]使用H L B固相萃取柱对地下水中五氯酚富集净化,检测限为30n g/L;万译文等[17]分别采用H L B固相萃取柱和MA X固相萃取柱对渔业水体和渔业饲料中的五氯酚进行富集净化,检测限分别为50n g/L和0.8μg/k g㊂本研究采用MA X固相萃取柱对水样及饲料中的五氯酚进行富集净化,较现有方法达到了更高的灵敏度,水样及饲料中的五氯酚检测限分别降低至5和0.1μg/k g㊂3.2基质效应的校正在L C-M S检测分析中,由于共流出以及电离竞争抑制现象的存在,往往会使目标化合物的响应信号偏离,存在基质效应[37]㊂基质效应会影响方法的灵敏度㊁精密度及准确度㊂本试验中以M F衡量基质效应,当M F值=1时,表示无基质效应;M F 值<1时,则基质抑制;M F值>1时,则基质增强㊂由本试验测定结果可知,各基质养殖投入品中,存在较强的基质效应干扰㊂目前降低基质效应的方法主要包括稀释样品溶液㊁增加净化步骤㊁优化色谱分离条件㊁采用同位素内标物㊁配制基质匹配标准溶液等,其中采用同位素内标法可准确地消除基质效应带来的影响,但市场上暂无五氯酚同位素内标的售卖,且由于稀释样品溶液㊁增加净化步骤等处理皆会使方法灵敏度和准确性下降,因此为了得到准确结果,减少基质效应对结果的影响,本研究采用绘制基质匹配标准曲线进行定量㊂由本试验结果可知,各基质匹配标准曲线线性关系良好(R2>0.999),精密度及准确度均可满足检测要求,因此采用基质匹配外标法可较好地抵消基质效应对五氯酚定量结果的干扰㊂3.3五氯酚风险监测使用本研究所建方法对配合饲料㊁饲料原料㊁饲料添加剂以及养殖用水等养殖投入品进行筛查,由结果可知,饲料原料和养殖用水中均未检出五氯酚;配合饲料中仅有两份检出五氯酚,且含量较低,低于方法定量限;而饲料添加剂样品存在较高污染风险,其中一些含氯元素的氨基酸盐酸盐及类维生素添加剂中检测到了较高含量的五氯酚,疑似生产过程中引入杂质所产生的副产物,需要进行重点关注㊂4结论本研究采用固相萃取法及H P L C-M S/M S技术建立了猪配合饲料㊁饲料原料㊁饲料添加剂㊁养殖用水中五氯酚检测方法,通过优化前处理条件及仪器条件,该方法在各基质定量范围内线性关系良好,灵敏度高,准确性好,重现性高,加标回收率试验和精密度试验结果均符合相关要求,适用于猪配合饲料等养殖投入品中五氯酚的测定,可应用于五氯酚风险筛查㊂经研究发现含氯添加剂样品较易受五氯酚污染,应当予以关注㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]潘胜东,陈晓红,何仟,等.超高效液相色谱-高分辨质谱确证分析泥鳅体内五氯酚代谢物[J].色谱,2017,35(12):1245-1250.P A NSD,C H E N X H,H E Q,e t a l.C o n f i r m a t i o na n da n a l y s i s o f t h e m e t ab o l i t e s o f p e n t ac h l o r o p h e n o l i nl o a c h e su s i n g u l t r a-p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y-h i g hr e s o l u t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y[J].C h i n e s eJ o u r n a lo f C h r o m a t o g r a p h y,2017,35(12):1245-1250.(i nC h i n e s e)[2]黄轶昕.我国灭螺药物研究和现场应用[J].中国血吸虫病防治杂志,2019,31(6):679-684.HU A N G Y X.R e s e a r c ha n d f i e l da p p l i c a t i o no f s n a i lk i l l i n g d r u g s i n C h i n a[J].C h i n e s e J o u r n a l o fS c h i s t o s o m i a s i sC o n t r o l,2019,31(6):679-684.(i nC h i n e s e)[3] X U Q,A I S,G E G,e t a l.H u m a n h e a l 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t o g r a p h y-t r i p l eq u a d r u p o l e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c o m b i n e dw i t hQ u E C h E R S[J].C h i n aF o o dS a f e t y M a g a z i n e,2023,12:45-47.(i nC h i n e s e)[22]陆阳,朱鹏飞,姚誉阳,等.固相萃取-高效液相色谱法测定纸质食品包装材料中五氯酚含量[J].食品安全质量检测学报,2022,13(1):65-71.L U Y,Z HU PF,Y A O Y Y,e t a l.D e t e r m i n a t i o no fp e n t a c h l o r o p h e n o lc o n t e n ti n p a p e rf o o d p a c k a g i n gm a t e r i a l sb y s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n-h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t ya n dQ u a l i t y,2022,13(1):65-71.(i nC h i n e s e)[23]杨霄,李小玲,刘伶俐,等.大体积固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定地表水中的五氯酚[J].湖南师范大学自然科学学报,2021,44(4):119-125.Y A N G X,L IX L,L I U L L,e t a l.D e t e r m i n a t i o no fp e n t a c h l o r o p h e n o l i ns u r f a c e w a t e rb y l a r g e-v o l u m es o l i d p h a s e e x t r a c t i o n,h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y-t a nde m 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高效液相色谱法测定阿戈美拉汀片有关物质
高效液相色谱法测定阿戈美拉汀片有关物质摘要：目的：建立高效液相色谱法测定阿戈美拉汀片的有关物质的方法。
方法：采用Welchrom-C18（5μm，4.6*250mm）色谱柱，以0.01mol/L的磷酸氢二钠溶液（用稀磷酸调节pH值至3.0）-甲醇-乙腈（50：30：20）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为229nm，柱温为30℃。
结果：在该色谱条件下，阿戈美拉汀与各中间体、杂质分离良好，辅料对有关物质检测无干扰。
结论：该方法专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于该制剂中有关物质的检测。
关键词：阿戈美拉汀片有关物质高效液相色谱法阿戈美拉汀片（Agomelatine Tablets）是法国施维雅药厂（Les Laboratoires Servier Industrie）研制的新一代抗抑郁药，既是首个褪黑素受体激动剂，也是5-羟色胺2C（S-HTx）受体拮抗剂。
该药有抗抑郁、抗焦虑、调整睡眠节律及调节生物钟的作用，可在不影响白天活动的情况下改善夜间睡眠状况，其不良反应少，也未见撤药反应。
目前各国药典中尚未收载该品种的有关物质检查方法，国内文献亦尚未报道。
为有效控制产品质量，本文采用高效液相色谱（HPLC）法[1]，参考有关文献[2，3]对阿戈美拉汀片中有关物质进行了检测，结果该方法专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于该制剂中有关物质的检测。
一、仪器与试药1.仪器岛津SPD-20AT高效液相色谱仪2.样品阿戈美拉汀对照品（山东方明药业集团股份有限公司，批号：120301J，含量：99.7%）；阿戈美拉汀片（山东方明药业集团股份有限公司，批号：20120501、20120502、20120503，规格：25mg）；杂质A对照品（2-（7-甲氧基-1-萘基）乙胺盐酸盐，山东方明药业集团股份有限公司，批号：120303，含量：99.5%）；杂质B对照品（（7-甲氧基-1-萘基）乙腈，山东方明药业集团股份有限公司，批号：120304，含量：99.8%）。
HPLC法同时测定氟雷拉纳原料药中的4种杂质
2021年第5期广东化工第48卷总第439期 · 185 · HPLC法同时测定氟雷拉纳原料药中的4种杂质黄丽霞*，冯绮晴，李冰冰，姜桥(丽珠集团新北江制药股份有限公司合成研发中心，广东清远511515)[摘要]建立了高效液相色谱法同时测定氟雷拉纳原料药中4种杂质检测的方法。
采用色谱柱SunFire C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈：0.03 % TFA水溶液，进行梯度洗脱，对氟雷拉纳4种杂质的纯度进行定量测定。
结果显示，空白溶剂无干扰，且各杂质与氟雷拉纳均得到有效分离，分离度均大于1.5。
4种杂质质量浓度在0.15~1.14 mg·L-1范围内线性良好(r＞0.9990)，平均回收率为95.18 %~97.21 %之间，均符合方法学验证要求。
该方法符合杂质分析要求，可用于氟雷拉纳原料药中4种杂质的同时测定。
[关键词]氟雷拉纳；杂质；高效液相色谱法[中图分类号]S859.2 [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2021)05-0185-03Simultaneous Determination of Four Impurities in Fluralaner API by HPLCHuang Lixia*, Feng Qiqing, Li Bingbing,Jiang Qiao(Synthesis R&D center, Livzon New North River Pharmaceutical Co., Ltd., Qiangyuan 511515, China) Abstract: A method based on high performance liquid chromatography (HPLC) was developed for determination of four impurities of Fluralaner．The purity of the four impurities of Fluralaner was determined by gradient elution on Sunfire C8 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with acetonitrile and 0.03%TFA aqueous solution as mobile phase. The results showed that there was no interference in the blank solvent, and the impurities were separated from Fluralaner effectively, and the separation degrees were all greater than 1.5. The mass concentrations of the four impurities were linear in the range of 0.15~1.14 mg·L-1 (r＞0.9990), and the average recoveries were 95.18 %~97.21 %, which all met the requirements of methodological verification. The method meets the requirement of impurity analysis and can be used for simultaneous determination of four impurities in Fluralaner API.Keywords: Fluralaner；Impurity；High Performance Liquid Chromatography异噁唑啉类化合物氟雷拉纳(Fluralaner)是一种新型长效的抗寄生虫兽药，对蜱目、蚤目、半翅目和双翅目等体外寄生虫有较好的杀虫活性，其对害虫的毒性高于常用杀虫剂[1-3]，主要用于治疗猫﹑狗等动物的体外寄生虫感染。
(Mobile phase)——液体或气体色谱柱(Column)
色谱法简单分类
按溶质在分离过程中的原理：
• • • 吸附色谱 分配色
高效液相色谱(HPLC) High Performance Liquid Chromatogrphy
高选择性 高效能 高灵敏度 分析速度快 应用范围广
对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
HPLC原理及基本操作
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、 分析方法 目的：定性分析或定量分析
1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立(命名) 植物色素分离 2．现在：一种重要的分离、分析技术 固定相(Stationary phase)——固体或是液体 流动相(Mobile phase)——液体或气体 色谱柱(Column)——各种材质和尺寸 被分离组分——不再仅局限于有色物质
4、环境分析
5、精细化工
发展趋势
1.新型固定相: 如手性固定相.
2.新型检测器(Detector): 如PFPD(GC),
ELSD(PHLC). 3.色谱新方法: 如SFC, HPCE, 4.色谱联用技术: 如GC-MS, GC-FTIR, PHLC-MS, SFC- MS, GC-ICPAES. 5.色谱专家系统: 优化样品处理,分离条 件,定量及结果分析
1. 储存和输
送液体设
备
2. 进样系统
3. 柱系统 4. 检测器 5. 控制和数 据处理系 统
1. 保留时间 tR(retention time) 2. 死时间t0： 3.调整保留时间tR’
t t R t0
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高效液相色谱的流动相（Mobile Phase）－－Aladdin
液相色谱流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。
与气相色谱相比较，液相色谱流动
相不仅可选择范围比较大，而且它是影响分离的一个非常重要的可调节因素。
在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。
一、流动相溶剂的选择
高效液相色谱中所选用的流动相溶剂必须能保证该色谱系统的分离过程可重复进行：
溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求；溶剂应当不干扰检测
器的工作；在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。
从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。
对液相色谱溶剂的要求：
1）溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。
2）溶剂应与检测器匹配，不影响检测器正常工作。
3）溶剂对样品要有足够的溶解能力，以提高检测灵敏度。
4）溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。
5）溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收。
液相色谱流动相溶剂的选择步骤：
选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等；
选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 ≤ k'≤ 5；复杂样品，0.5 ≤ k'≤ 20
改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值
二、表征溶剂特性的重要参数
1)溶剂沸点、分子量、相对密度、介电常数、偶极距、折射指数、紫外吸收截止波长、
与液相色谱分离密切相关的最重要的溶剂特性参数是溶剂强度参数?? ，溶解度参
数?? ，极性参数P'和粘度η。
2) 溶剂洗脱强度
溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力。
在吸附色谱中, "溶剂洗脱强度"与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。
在液相色谱常用混合溶剂作流动相。
混合溶剂的P'具有加和性：
P'ab = ??a P'a＋?? b P'b , ??为某一溶剂的体积分数。
溶剂极性对容量因子的影响：
②正相色谱：k2' / k1' = exp [(P1'－P2')/2]
②反相色谱：k2' / k1' = exp [(P2'－P1')/2]
在液相色谱中, 一般溶剂的极性变化二个单位, 溶质的分配比差不多能有十倍的变化。
3）溶剂选择性分类
按溶剂分子的特殊作用类型（色谱选择性）进行分类, 采用三个不同的常数表示：
①X e(接受质子参数)~易与含羟基的分子作用(如酸类、酚类)；
②X d(给质子参数)~易与碱性化合物作用(如胺、亚砜等)；
③X n(强偶极参数)~易与偶极距较大的溶质分子作用(如硝基化合物、腈、亚砜和胺类等)。
溶剂的三个选择性参数相近，其选择性相似。
改变色谱选择性，应从相距较远的溶剂组挑选其他溶剂。
4) 流动相的优化
通过考察流动相组成对保留时间和分离因子等色谱参数的影响，获得最佳的分离选择性和较短分析时间。