2020秋季 基因工程 第9章 基因工程抗体 第2部分
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。
基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。
基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。
这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。
2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。
这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。
3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。
这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。
4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。
这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。
基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。
2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。
3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。
4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。
基因工程抗体
基因工程抗体综述前言：抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。
Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。
于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词，泛指抗毒素一类的物质，而将引起相应抗体产生的物质称为抗原（antigen）。
1896年Gruber和Durham发现了凝集素。
1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。
于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。
直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。
免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。
在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。
但事实上，具有抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。
在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可见，抗体是一个生物学和功能的概念，可理解为能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白则是一个结构概念，除抗体外，它尚包括正常个体中天然存在的免疫球蛋白及病理情况下（如骨髓瘤，巨球蛋白血症及冷球蛋白血症等）患者血清中的免疫球蛋白及其亚单位等，因此，抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性，至少目前尚不了解这此天然的或病理的球蛋白的免疫功能。
《基因工程抗体》PPT课件
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在
PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体 全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。
基因工程抗体片段课件
• 3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经 性疾病和脑肿瘤的新药
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基因工程抗体片段
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VHH稳定的机制
• 传统抗体的VH 和VL 区通过疏水作用形成稳 定结构，而重链抗体则通过选择性突变VHH 胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲 水性表面，可在缺失VL 条件下保持结构稳定；
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VHH 胚系基因序列特性
• 1）对骆驼VHH 胚系基因序列分析发现， VHH 与人源VH 基因Ⅲ家族序列具有较 高的同源性；
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• 2）比较人类和骆驼IgG 重链可变区发现，在框架
FR2 区的氨基酸组成中，有4 个氨基酸显著不同。这 4 个氨基酸在VH 和VHH 中分别是V42F 或V42Y， G49E，L50R 和W52G，，
• 是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；
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ScFV的功能
• 1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部 位, 如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面 的腔囊等；
• 2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点： 多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具 有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或 药物等, 用于影像和临床治疗；
基因工程抗体片段之前奏曲 ———小分子抗体
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第一代小分子抗体———抗原结合片段 ( fragment with antigen binding，Fab重链的VH + CH1构成， 其大小为完整抗体的1/3,约55KD；
基因工程抗体PPT课件
cover illustration Antibody single-chain fragment stability-engineered by point mutations (A) and by a CDR-graft to the most stable human consensus framework (B). Insufficient thermodynamic stability can limit the use of particular antibody fragments as targeting moieties in therapeutic constructs, such as e.g. immunotoxins or immunoliposomes. This limitation can be overcome by a graft of the antigen combining site to a more stable antibody framework. However, such grafts sometimes fail to reach the superior stability of the acceptor framework. Comparison with the stabilization obtained with a set of designed point mutations shows that this is not always due to destabilizing interactions within the complementary determining regions, but to subtle structural differences between different classes of antibody frameworks that introduce strain in CDR grafts to divergent frameworks. For further details please see Kügler et al. (pp.135–148) and Honegger et al. (pp. 121–134).
《基因工程抗体》PPT课件
（三）单链抗体（single-chain antibody
） • 又称FV分子。
• 目的：基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体 蛋白。
• 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。此外肽 连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。
优点
• 这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单 克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性 杀伤；能进入实体瘤周围的微循理：可将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
• 催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在 的高效催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
（二）催化抗体的制备
• 催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物 ，是将抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新 方法，故而显示出较高的理论和实用价值，成为酶工程领域中的研究热点。
2. 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 3. 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 4. 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 5. 筛选分泌鼠－人嵌合抗体的骨髓瘤细胞
所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分 泌的抗体特异性和亲和力相同，但减 少了抗体中的鼠源性成分
（二）重构抗体（reshaping anti body）
基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
• 随着DNA重组技术以及其它分子生物学技术的发展，人们利用基因工程技术来制备抗体 分子，这种抗体分子称为基因工程抗体，这是分子水平的抗体。
基因工程抗体
（三）双链抗体（diabody)及三链抗体 （triabody)
通过缩短scFv的接头，使两个单链抗体分子间互 相形成VH和VL配对，以非共价键结合在一起形成二 聚体，从而构建出的双价小分子抗体。
如果将两个不同特异性的单链抗体分子的VH和VL 交叉组合构建两个杂合的单链抗体基因，重组到同 一表达载体中，则可在大肠杆菌中表达出双特异双 链抗体。
• 细胞内抗体的应用 表型敲除：在细胞内表达特定抗体分子阻断某 内源蛋白的活性，可用研究靶蛋白的生物学功 能。 基因治疗：通过细胞内抗体对某些蛋白功能的 干扰也可达到基因治疗的目的，如利用癌基因 的细胞内抗体为抗肿瘤的基因治疗提供了一个 新的途径。 目前抗HIV gp120（外壳蛋白）的Fab段和抗Tat （调节蛋白）的scFv已进入临床试用。
• 缺点 有时ScFv比其亲本抗体的亲和力明显降
低，并常常显示聚集倾向，尤其在37度
时稳定性较差，这与轻重链可变区由作
用力较弱的非共价键连接在一起有关。
四、dsFv
• 在VH和VL之间导入了一个链间二硫键，构 建了disulfide-stabilized Fv, dsFv。 二硫键可设计在CDR也可在骨架区。由于 CDR涉及抗原结合，需了解Fv段的立体结构 才能确定正确的引入二硫键的部位。在远 离CDR的结构较保守的骨架区设计二硫键， 具备通用性。
创新的癌症免疫疗法——BiTE抗体技。
• 今年9月，安进向FDA提交首个BiTE疗法blinatumomab上市 申请。
• FDA日前表示，已接受审查BiTE免疫疗法blinatumomab生物
制品许可申请（BLA），同时已授予该药优先审查资格。 • 此前，FDA和EMA均已授予该药孤儿药地位，FDA还授予该 药突破性疗法认定。
基因工程抗体
基因工程抗体你的单抗杂交瘤细胞株产不出抗体，不妨试试基因工程抗体基因工程抗体的概念比较广本文仅仅讨论怎么从杂交瘤细胞株开始做基因工程抗体主要解决如下几个问题：1. 知识产权保护的需要，给细胞株建立指纹身份；2. 更容易发文章；3. 序列比细胞株更容易保存；4. 对于不容易从腹水或者培养制备抗体的细胞株换个思路5. 人源化抗体的需求6. 嵌合抗体潜在需要从杂交瘤细胞株做单克隆抗体，主要解决分三大步骤：1. 杂交瘤细胞株测序测序的方法主要有两种，1)兼并引物设计（degenerate primer）分别扩增抗体重连和轻链的可变区2)RACE法，RACE即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends),是一种基于逆转录PCR从样本中快速扩增cDNA的5′端及3'端的技术方法1）更加的节约成本，便捷高效；但是很多的实验室不掌握核心的兼并引物设计方法，只能选择RACE方法。
2. 载体构建分别构建重链和轻链的表达质粒，表达载体的选择和元件优化组合尤为重要，除了大家认为密码子优化问题，还有载体的信号肽选择尤为重要，这个决定抗体的表达水平，一般优先选择V5信号肽，当抗体产量不高的时候也可以试试其他的信号肽，筛选最优；当然载体的抗体的骨架选择也是需要注意的。
3. 共转染哺乳动物细胞表达抗体的表达一般选用HKE293或者CHO细胞系，好用的细胞系一般都是商业化公司压箱底至宝，不会轻易流出，其配套的转染试剂和培养基也是经过特殊优化的，培养基和转染试剂是可以公开出售的。
进行以上实验，必须要1.2.0*10^6以上的杂交瘤细胞，越纯越好；杂交瘤细胞株测序的难点在于基于PCR的引物对的设计，很多实验室没有这个技术，按照文献发表的序列重复，往往也效果不好；这个时候可以委托专业化公司帮忙。
基因工程表达抗体的益处：长期做单抗的实验室都知道，经常遇到杂交瘤细胞株产生抗体能力越来越弱或者抗体效价越来越低，主要原因可能是抗体基因发生突变，因此早期测序留住抗体基因尤为重要，对于规模化生产单抗的均一性更为重要。
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转基因小鼠原理：
• 把小鼠编码Ig基因（重链、轻 链）的基因剔除。
• 制备表达人的Ig重链、轻链的 转基因小鼠。
• 当用抗原免疫后，小鼠可产生 完全人源抗体。
鼠胚胎干细胞 囊胚
XenoMouse®
• 转基因小鼠（transgenic mice） • 人抗体展示技术（Human
antibody-display libraries） • 人B细胞永生化 • 单B细胞RT-PCR技术
一、人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
• 从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V 区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式重组，克隆到表达载体中构 建鼠－人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入宿主细胞表达，经筛选 后制备成特异性的嵌合抗体。
人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
PCR 鼠抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
人抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
嵌合轻链
嵌合重链
IgG
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
• 基于XenoMouse开发的第一个单抗药物是Abgenix与 Amgen 共 同 开 发 的 抗 EGFR 单 抗 panitumumab （Vectibix），FDA于2006年批准Panitumumab上市， 其是第一个基于转基因小鼠的全人源性单抗药物，也是 批准得的第一个全人源单抗药物，而来自噬菌体呈现抗 体库技术的全人源单抗药物Humira于2008年由FDA批 准上市。
骨架区（FR）的某些氨基酸可与CDR有相互作用或影响 分子构象，简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的
亲和力。→使用与鼠FR较大同源性人FR
三、全人抗体的实现途径：转基因小鼠
• 为了开发全人源的抗体药物，在上世纪90年代，随着转 基因基因的发展，多个生物技术公司成功构建了转入H
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
人 鼠 嵌 合 抗 体
人-鼠嵌合抗体
MabThera（美罗华，通用名：rituximab，利妥昔单抗）： for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
二、人源化抗体（CDR移植抗体）
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
The fact that nearly half of all US Food and Drug Administration (FDA)approved therapeutic mAbs are humanized antibodies testifies to their safety and tolerance by humans.
• 最早由加州湾区的Cell Genesys公司开发，其于1996年 将XenoMouse技术平台分离出来成立了Abgenix公司。
• Abgenix是硅谷最成功的故事之一。Abgenix公司成立 于1996年，于1998年成功上市。
• 在2005年底，Amgen公司以22亿美元的价格收购了 Abgenix。
→ 人体把这些单抗药当作异体蛋白，会产生免疫排斥； → 免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉，大大降低了它
们应有的疗效； → 少数病例中，鼠源抗体会引起严重的过敏反应，甚至导致了
个别病人的死亡。
• 如何解决这个问题？
• 单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床， 经历了一段曲折 的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
人源化方案一：鼠单抗人源化
• 杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体 产生人抗鼠抗体及毒副作用→对鼠 源性的单抗进行人源化改造。
①恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 (Chimeric Antibody)
②可变区人源化——人源化抗体 （humanized antibody or Reshaped Antibody ）
• 为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，克隆出鼠源抗体中与抗 原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。 由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为 CDR移植抗体（CDR grafted antibody）或人源化抗体 (humanized antibody) 。这种抗体在人体内免疫性大为降低。
FV regions CDRs from from mouse mouse
Mouse antibody
Chimeric antibody
(66%)
Humanized Fully antibody human (90%) antibody
(100%)
方案二：全人源单抗 （Fully human mAbs）
基因工程抗体的基本原理
1. 从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA 2. PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因 3. 构建表达载体 4. 在宿主细胞中表达并折叠 5. 筛选出高表达细胞株 6. 亲和层折等手段纯化抗体片段
• 单克隆抗体药来自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗体在给病人 服用过程中常常遇到一些问题:
生物制药专业《基因工程，Genetic Engineering》教学计划
第一章 基因工程的研究内容和应用（2学时）第1周 第二章 基因工程的工具酶（4学时）第2，3周 第三章 基因工程的载体系统（4学时）第4，5周 第四章 克隆基因的原理与方法（2学时）第6周 第五章 重组DNA分子的构建、导入受体细胞及筛选 （2学时）第7周 第六章 大肠杆菌基因工程 （4学时）第8，9周 第七讲 真核生物基因工程 （6学时）第10，11，12周 第八章 转基因动物与转基因植物 （4学时）第13，14周 第九章 基因工程抗体（4学时）第15，16周
• 鼠单抗的可变区+人抗体的恒定区 =嵌合抗体 Chimeric Antibody
• 在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生 的抗体含有70-80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少了单克隆 抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分，在实际应用过 程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。