基因克隆-256页PPT

构成：质粒复制起始点、一个或多个限制性 内切酶位点、抗药性基因、λ噬菌体的cos位 点。粘粒载体大小为4～6kb。
粘粒克隆外源DNA的步骤：
外源DNA与粘粒载体用同一种内切酶酶切； 连接酶连接，外源DNA插入到两个线状粘粒之间； 离体包装，组成成熟的噬菌体颗粒。该过程对DNA分子长 度有严格的限制，过长或过短均不能被包装，所以虽然粘 粒只有几千个碱基，但要求插入的外源基因却必须是大片 段（25～45kb）。 体外包装好的颗粒感染宿主菌，重组载体由于缺乏噬菌体 其他部分基因，故不能像噬菌体一样复制，只能像质粒一 样扩增。
克隆载体与表达载体
克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA 片段（目的基因），以便进一步研究其结构和 功能；本章主要以克隆载体为例讲解。 表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA， 进而合成相关蛋白质。
二、质粒载体
1 概念
Plasmid ： 细 菌 染 色 体 外小型双链环状DNA，对 细菌的某些代谢活动和抗 药性的表型具有一定的作 用。
宿主细胞，常见的有大肠杆菌、酵母等。
2载体的特征：
能自主复制； 具备筛选标记； 适当大小的分子量和适当限制性内切酶 酶切位点； 在细胞中拷贝数高 除上述特征外，表达载体还应配备有与 宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、 加尾信号、增强子等调控DNA元件。
3 载体的分类
按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等； 按用途和功能分：克隆载体和表达载体。
外源基因插入载体后，lacZ被破坏，不能分解 X-gal，菌落呈白色。——“蓝白斑”筛选法。
7质粒载体的主要用途
保存和扩缺点：所能接受的DNA片段容量小；转化效率低。
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体的基因组是约50kb的线性双链 DNA分子，两端各有12个核苷酸的5’突 出，碱基互补（cos位点，又称粘端）。 λ噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基 配对而结合，形成环状DNA分子。
1λ噬菌体在细菌内的生长方式：
裂菌性生长（lytic pathway）：在宿主菌中大 量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主菌 裂解。 溶菌性生长（lysogenic pathway）：整合到 宿主菌DNA分子中，随宿主菌DNA复制并转到 子代细菌中。
2λ噬菌体结构
野生型的λ噬菌体基因组庞大而复杂，有约48.5kb，约占基因组总长 度30％的中间部分的基因对噬菌体生长是非必需的，可以直接插入外源 基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、 复制起始点（ori）
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
Autonomously replicating DNA molecules
(have an origin of replication)
Selectable marker, such as drug resistance Insertion site for foreign DNA
(often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes)
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
multiple cloning sites
人工合成的DNA序列，含有密 集排列的多种限制性内切酶识别 序列，以利于不同来源的外源 DNA片段插入载体。
Hale Waihona Puke pBR系列载体4 pBR质粒载体筛选的原理
5 pBR质粒载体的筛选方法——双抗生素对照筛选法
6 pUC系列载体
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。 外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
1载体（vector）
携带靶DNA片段（外源DNA片段） 进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别
严紧型质粒
松驰型质粒
质粒复制所需的酶
每个细胞中所含的质 粒数 质粒复制与细菌复制 的关系 在基因克隆中的应用 前景
DNA聚合酶 Ⅲ
1～5个
密切
小
DNA聚合酶Ⅰ
10～200个以上 能在没有蛋白质合成 的情况下继续复制
大
3 Specificity of Plasmid Vectors
此载体中央部分两端有三个酶切位点。可插 入片段的行真核基因组文 库构建时，其容量仍然受到一定的限 制。最大插入片段不能超过23kb。
四、粘粒载体
1978年构建，由质粒和噬菌体的cos粘 性末端构建而成。插入片段29～45kb。 可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性 克隆细胞株。
3 插入载体
经人工改造而成，具有单一的 EcoRⅠ 酶 切 位 点 ， 该 酶 切 位 点 位 于 lacZ基因内，使用蓝白斑筛选法。插入 片 段 长 度 约 几 个 k 替代载体
λ噬菌体基因组中央部分约有14kb主要 编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需， 作为载体这部分可被外源DNA所替代。