碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2的研究
铜绿假单胞菌耐药的风险因素分析与治疗
时间定义不清晰、有研究认为使用 5 天足够对患
者菌群造成明显影响。
Ju-Hsin Chia, Lin-Hui Su, Ming-Hsun Lee, et. Development of High-Level Carbapenem Resistance in Klebsiella pneumoniae Among Patients with Prolonged Hospitalization and Carbapenem Exposure [J]. Microb Drug Resist, 2010; 16(4): 317-325.
选择碳青霉烯经验性初始治疗前 考虑的第一个问题
既往是否有碳青霉烯暴露史 既往是否有ICU入住史 既往是否有机械通气病史 既往是否有铜绿或鲍曼分离病史 是否留置各类植入导管或装置 住院时间是否超过1周，所在病房是否有铜绿、鲍曼流行
CRPA、CRAB、CRKP感染风险
是否有较碳青霉烯更佳的选择？
碳青霉烯是肠道CR-PA定植的危险因素
亚胺培南暴露 后患者生存率 显著下降
Didier Lepelletier, Anne Cady, Nathalie Caroff, et.Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal carriage among hospitalized patients: risk factors and resistance mechanisms [J]. Diagn Micr Infec Dis 2010; 66: 1-6.
碳青霉烯暴露是耐药菌感染的危险因素
多因素分析发现，三种因素导致耐药的 革兰氏阴性菌感染发生，其中包括之前使用 过碳青霉烯类抗生素
耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展
耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展何宇婷;黄彬【摘要】碳青霉烯类抗生素是治疗铜绿假单胞菌感染的有效药物,但随着此类抗生素的广泛应用,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈上升趋势.本文从药物的主动转运系统、抗菌药物渗透障碍、产生药物灭活酶及形成生物被膜这4个方面对耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进行综述,为临床合理应用抗生素和进行感染防控提供理论依据.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2017(009)003【总页数】6页(P206-210,214)【关键词】铜绿假单胞菌;碳青霉烯类抗生素;耐药机制;耐药基因【作者】何宇婷;黄彬【作者单位】中山大学附属第一医院检验医学部,广东,广州510080;中山大学附属第一医院检验医学部,广东,广州510080【正文语种】中文铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是假单胞菌属的代表菌种，广泛分布于自然界、土壤、水和空气中，在人体皮肤、肠道和呼吸道均存在。
铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院感染的主要病原菌之一［1-2］。
近年来，社区感染的多重耐药铜绿假单胞菌不断增多，也引起了人们的关注［3］。
美国国家医院感染监测系统的报告指出，铜绿假单胞菌在所有院内感染致病菌中检出率居第5位，在革兰阴性细菌中检出率居第2位［4］。
近年来，铜绿假单胞菌对临床多种常用抗生素呈现明显的多重耐药甚至泛耐药，一旦感染，临床治疗十分棘手。
碳青霉烯类抗生素是抗菌谱广、抗菌活性强的非典型β-内酰胺抗生素，主要包括亚胺培南、美罗培南和比阿培南等。
目前，碳青霉烯类抗生素已成为临床治疗严重感染类疾病的一线药物，特别是治疗产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）和头孢菌素酶的多重耐药菌引起的感染［5-6］。
临床上，碳青霉烯类抗生素是治疗铜绿假单胞菌感染的有效药物，但随着此类抗生素的广泛应用，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率有上升趋势。
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及部分耐药机制研究的开题报告
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及部分耐药机制研究的开题报告题目：铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及部分耐药机制研究一、研究背景和意义铜绿假单胞菌是一种常见的多药耐药病原菌，广泛存在于医院环境和医疗设备中，对全球卫生健康造成威胁。
碳青霉烯类抗生素是目前治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物，但近年来已经出现了铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药现象，严重威胁了临床治疗。
因此，开展铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其机制研究，对于制定治疗方案、控制耐药性的发生和传播具有重要意义。
二、研究内容和方法1. 收集不同来源、不同临床表现的铜绿假单胞菌菌株，通过双盘法测定其对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多黏菌素类抗生素以及碳青霉烯类抗生素的耐药性，分析其耐药性分布情况及趋势。
2. 进行PCR扩增和基因测序，筛选得到与铜绿假单胞菌耐药性相关的β内酰胺酶、外膜孔蛋白、质粒、调节基因等相关的基因序列，对其进行序列比对和进化树构建，分析不同菌株间基因的差异性。
3. 构建耐药菌株和敏感菌株大小子单位的膜蛋白提取，利用Western blotting技术对比分析其膜蛋白组成差异，同时对膜蛋白组成异质性进行质谱鉴定和分析。
4. 通过结合实验和分子模拟的方法筛选潜在的新型碳青霉烯酶抑制剂。
利用一些已知的碳青霉烯酶抑制剂作为模型，针对动态模拟可能的抑制机制进行相关的早期筛选实验。
三、预期结果及意义1. 确定目前碳青霉烯类抗生素对铜绿假单胞菌的耐药情况及趋势，掌握其耐药机制并防止其传播，为选择合适的治疗方案提供参考。
2. 确定与铜绿假单胞菌耐药性相关的关键基因并进行鉴定，对基因演化和组成进行深入的研究，为探索新型治疗手段和疫苗的研发提供基础数据。
3. 确定耐药和敏感菌株膜蛋白组成的差异性，为进一步研究耐药机制提供数据支持。
4. 筛选潜在的新型碳青霉烯酶抑制剂，为治疗铜绿假单胞菌感染的开发新型治疗药物提供参考，为对抗多药耐药菌种提供战略意义。
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究[关键词] 铜绿假单胞菌；耐药性；美罗培南；亚胺培南各种抗假单胞菌药物在治疗铜绿假单胞菌感染过程中或治疗后可出现不同程度的耐药导致治疗失败，但各种药物诱导耐药的相对危险性可有差异。
了解铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制，及时掌握新的耐药动向及其相关因素，有助于制定切合实际的控制耐药方案。
1铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制OprD为铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白，可被动性摄取碱性氨基酸，亦可渗透碳青霉烯类药物。
对亚胺培南的渗透率为736nm／s，对美罗培南为73nm／s，表明亚胺培南透入铜绿假单胞菌比美罗培南快10倍。
OprD丢失后，两者的渗透率分别为6nm／s及5.5nm／s，对亚胺培南的MIC从1-2mg／L上升到8-32mg ／L，对美罗培南的MIC从0.12～0.5mg／L上升到2~4mg／L。
铜绿假单胞菌OprD丢失或下降是介导对亚胺培南耐药的主要机制，对美罗培南的影响较少可能与通过尚未确定的通道进入菌体有关。
因单纯OprD丢失不影响对非碳青霉烯类药物的敏感性，属窄谱耐药机制。
亚胺培南为强力β-内酰胺酶诱导剂，诱导铜绿假单胞菌产生Bush IB-内酰胺酶，Bush I酶可快速水解抗假单胞菌头孢菌素类及青霉素类药物，但对亚胺培南只具缓慢水解作用。
铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白(OprD)丢失可引起对亚胺培南耐药，但若单纯OprD丢失而无β一内酰胺酶参入，则对亚胺培南的MIC只由0.25mg ／L增至0.5mg／L，若OprD丢失同时伴口一内酰胺酶的作用，则可使其MIC 增至16mg／L，表明β-内酰胺酶与渗透性改变介导对亚胺培南耐药具协同作用。
美罗培南比亚胺培南对β-内酰胺酶更稳定，OprD丢失伴β-内酰胺酶作用仅使铜绿假单胞菌对美罗培南的MIC增至2-4mg／L。
产金属β-内酰胺酶的菌株亦可能需要OprD丢失才对碳青霉烯类耐药，虽然产金属酶类药物仍属少见，但正在成为铜绿假单胞菌对亚胺培南及美罗培南高度耐药的原因，并可能成为今后严重的问题。
铜绿假单胞菌感染和耐药机制
铜绿假单胞菌感染和耐药机制铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌，是条件致病菌，它对健康的机体几乎不会引起感染，但是对免疫受损的机体可以引起严重的感染，免疫受损的机体包括囊性纤维化患者，癌症病人，艾滋病毒感染者，严重烧伤病人[1] 。
由于传统的抗生素治疗，使铜绿假单胞菌对许多抗生素产生了严重的耐药性，它可以产生各种灭活酶或修饰酶, 如内酰胺酶等; 菌体蛋白结构和功能改变逃避抗菌药物作用; 膜屏障与主动排外; 形成生物保护膜等[4] ，来抵制抗生素的作用。
这也是在临床上很棘手的问题，使铜绿假单胞菌不仅成为难以治疗的病原菌，也使其成为众多研究细菌致病性和耐药性的对象。
首先来了解一下铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病。
1、铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病在临床上发现呼吸科和烧伤科铜绿假单胞菌感染率和检出率较高。
1.1 铜绿假单胞菌相关性肺炎它包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)，医院获得性肺炎(CAP，呼吸机相关性肺炎(VAP), 气管镜相关性肺炎，囊性纤维变性(CF等。
慢性阻塞性肺疾病( COPD) 慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是以感染为主要表现的疾病, 由于其呼吸道防御功能下降, 支气管清除能力减弱, 故能引起多种细菌的感染，铜绿假单胞菌感染是COPD病人急性加重的主要原因。
铜绿假单胞菌一开始就被认为是引起慢性阻塞性肺疾病(COPD的重要的致病菌[10] , Laura的研究证明铜绿假单胞菌引起COP爾人的慢性感染[11]。
医院获得性肺炎( CAP) 铜绿假单胞菌在社区获得性肺炎中不常见，但在医院获得性肺炎(CAP中较常见的病原菌之一[2]。
CAP是COPD常见并发症和重要死亡原因之一，近年来国内关于COPD患者合并CAP 方面的研究得到广泛关注。
同时由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原菌变迁和抗菌药物耐药率上升等原因, 其致病菌的组成和耐药特性在不同国家、不同地区之间存在着明显差异而且随着时间的推移而不断变迁[6] 。
碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵和外膜孔蛋白表达水平的研究
李红玲 ， 廖 康 ， 陈亚 岗 ， 俞云松 ， 李 兰娟
摘 要 ： 目 的 探 讨 我 国 临 床 分 离 的 碳青 霉烯 类 抗 生 素 耐 药 铜 绿 假 单 胞 菌 外 排 泵 ＭｅｘＡＢ—ＯｐｒＭ 和 外 膜 孑Ｌ蛋 白 ＯｐｒＤ 表 达 水 平 及 其 与 碳 青 霉烯 类 抗 生 素 耐 药 性 之 间的 关 系 。方 法 收集 我 国 １ ５个 省 市 ２８所 医 院 临 床 分 离 的铜 绿 假 单 胞 菌 ６５５株 ，琼 脂 稀 释 法 测 定该 菌 加 入外 排 泵 抑 制 剂 羟 基 氰 氯 苯 腙 （ＣＣＣＰ）前 后 对 亚 胺 培 南 和 美 罗 培 南 的 ＭＩＣ；ＲＴ ＰＣＲ 检 测 外 排 泵 ＭｅｘＡＢ－ ＯｐｒＭ 和 孔 蛋 白 ＯｐｒＤ！的表 达 水 平 ；十二 烷 基 硫 酸 钠 一聚 丙 酰 胺 凝 胶 电泳 （ＳＤＳ ＰＡＧＥ）和 蛋 白 印 迹 （Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）检 测 外 膜 孔 蛋 白 ＯｐｒＤ！。结 果 收 集 到 的 ６５５株 铜 绿 假 单 胞 菌 菌 株 对 亚 胺 培 南 和 美 罗 培 南 敏 感 率 分 别 为 ５２．５ 和 ５９．２ ，加 人 ＣＣＣＰ 前 后 其 对 亚胺 培南 和美 罗培 南 的敏 感 率 无 明显 变 化 ；５２．０ （５１／９８）美 罗 培 南 耐 药 株 ＭｅｘＡＢ ＯｐｒＭ 显 著 高 表 达 （Ｐ＜ ０．０５）， ４３．７ （５９／１３５）亚 胺 培 南 耐 药 株 ＯｐｒＤ！显 著 低 表 达 （Ｐ＜ Ｏ．０５），１４．８ （２０／１３５）亚 胺 培 南 耐 药株 ＯｐｒＤ２表 达 缺 失 ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ显 示 与 标准 菌株 ＰＡＯ１相 比 ，ＯｐｒＤ。表 达 水 平 减 低 菌 株 ＺＺ２０显 影 减 低 ，表 达 缺 失 菌 株 ＢＪ１不 显 影 。结 论 ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ 表 达 升 高 和 ＯｐｒＤ：表 达 降低 甚 至缺 失 是 我 国铜 绿 假 单 胞 菌 对 美 罗 培 南 和 亚胺 培 南 耐 药 的重 要 机 制 。 关 键 词 ： 铜 绿 假 单 胞 菌 ； 外 排 泵 ； 外 膜 孔 蛋 白 ； 羟 基氰 氯苯 腙 ； 实 时荧 光定 量 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 中图 分 类 号 ：Ｒ９７８．１１；３７８．９９１ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００９—７７０８（２０（）８）０６ ０４１４－０５
铜绿假单胞菌的耐药机制和感染治疗新策略
性 [25]。吴婷婷等人在 36 株异质性耐药菌株中检出了 6 株外膜孔
蛋白 OprD2 缺失的菌株，另有研究也显示 OprD2 编码基因的缺失 或插入导致菌株对亚胺培南耐药 [4]。徐伟红等也证明了 OprD2 缺 失的铜绿假单胞菌对亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟高度耐药 [6]。
0 引言
院内感染又称医院获得性感染，是指病人在住院期间发生的 感染，绝大多数的为细菌所致。铜绿假单胞菌为院内感染的主要 条件致病菌之一，是一种革兰阴性杆菌，具有黏附素、绿脓素、内毒 素、外毒素、多糖荚膜等多种毒力因子。近年来，由于抗生素在临 床治疗中的广泛使用，铜绿假单胞菌对多种抗菌药物也有了较强 的耐药性，多重耐药菌的比例也呈增长趋势，使得临床铜绿假单胞 菌感染的治疗难度大幅增加。本文旨在阐明铜绿假单胞菌的耐药 机制，寻找应对铜绿假单胞菌耐药性的有效方法。
对产 ESBL 的铜绿假单胞菌的病毒抑制因子的产生进行分 析发现毒素的分泌与 β- 内酰胺酶的产生有很强的相关性，携带 ESBL 的细菌比不携带 ESBL 的细菌致病性及耐药性更强。因 此，铜 绿 假 单 胞 菌 的 抗 性 可 能 与 抗 菌 活 性 酶、色 素 表 达 及 毒 力 基 因的表达有关 [28]。巴基斯坦某研究室对 102 株医院采集的铜绿 假单胞菌进行检测，最终发现两种与抗菌活性酶相关的耐药基因： CTX-M-15 和 OXA-10[29]。 1.2 外膜通透性的下降
OprD 基 因 编 码 OprD2 蛋 白，当 编 码 基 因 序 列 变 化 时 可 能 导 致 OprD2 孔蛋白表达减少或缺失，进而使细菌外膜通透性改变，从而 阻止碳青霉烯进入细菌，临床则表现出碳青霉烯类耐药 [9]。 1.3 激活外排
ICU铜绿假单胞菌对碳青酶烯类药物耐药性分析
的地 位 … 尤 其 在 ＩＵ感 染 中常 见 。 ， Ｃ 感染 或 多重 感 染 南 的铜 绿 假 单 胞 菌 （ｍ ｐ ｎ ｍ—ｅｉ ａｔ ｓｕ ｏ ｏ ａ ｉ ｉｅ ｅ ｒｓ ｔｎ ｅ ｄ ｍ ｎ — ｓ Ｐ 是 导 致 重症 患 者 预后 差重 要 原 因 。随着 碳 青 酶烯 类 ｓｅｕ ｉｏａ Ｒ Ａ）对 美 洛 培 南 的 耐 药率 为 ６ ． ％。 ａｒｇｎ ｓ， Ｐ Ｉ ６１ ０ 药 物 的广 泛使 用 ， 铜绿 假 单胞 菌耐 药性 Ｈ益严 峻 ，Ａ ＩＵ铜 绿 假单 胞菌 构成 及 耐药 率变 化见 表 １ Ｐ Ｃ 。
回顾 性分 析 ， 现报 道 如下 。
１ 材 料 与方 法
１１ 菌 株 来 源 从 ２ ０ ． ０ ６年 １月一 ２ １ ０ ０年 １ ２月
ＩＵ各 种 标本 共 分 离 的铜 绿 假 单胞 菌 ３３株 ，其 中 Ｃ ８
源 于 呼 吸 道 ３ ９株 （ ５９ ）尿 液 ３ ２ ８． ， ％ ４株 （ ． ）３ ３ ８９ 。 ８ ％ 菌 株 中剔 除重 复 菌株 ２ ０株 （ ．％） ５２ 。
的泛 耐 药 （ Ｄ 性 也 不 鲜 见 。 Ｐ Ｒ） 因此 ， 强 对 Ｐ 加 Ａ对 碳
表 １ 铜 绿假 单胞 茵对碳青酶烯 类药物近年情 况
青 酶 烯类 药 物耐 药 性监 测 ，对 ＩＵ抢 救 重症 患者 合 Ｃ 理 用 药 具 有 非 常 重 要 的意 义 。为 此 ，我 们 对 ２ ０ — ０６ ２１ ００年 ＩＵ患者 Ｐ Ｃ Ａ对碳 青 酶烯 类 药 物耐 药性 进 行
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
·论著·碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD 2的研究沈继录，朱德妹，吴卫红，王明贵摘要：目的研究铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD 2与碳青霉烯类抗生素耐药的关系。
方法琼脂稀释法测定14种抗菌药物对铜绿假单胞菌的MIC 。
PCR 扩增oprD 2编码基因并进行序列分析。
十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）观察碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD 2的变化，比较敏感株和耐药株外膜蛋白的差异，统计分析采用均数t 检验。
结果141株耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南药敏试验结果显示具3种模式，以亚胺培南和美罗培南同时耐药（IMP R MEM R ）为主，占66．7%；亚胺培南耐药和美罗培南敏感（IMP R MEM S ）占32．6%；亚胺培南敏感和美罗培南耐药（IMP S MEM R ）仅占0．7%。
PCR 扩增141株耐药株oprD 2编码基因结果136株耐药株oprD 2编码基因发生显著变异，变异位点呈现多样性。
其中34株细菌的oprD 2编码基因存在大片段缺失，6株的oprD 2编码基因中有插入片段，96株有小片段缺失或不同位置的多个点突变。
另4株产金属酶菌株及1株亚胺培南敏感（美罗培南耐药）株的oprD 2编码基因未发现异常。
对其中16株碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌进行SDS-PAGE 分析，结果显示10株IPM R MEM R 和5株IPM R MEM S 铜绿假单胞菌外膜蛋白均存在分子量46000u 处的OprD 2蛋白减少，而1株IMP S MEM R 株OprD 2蛋白带未见异常。
结论oprD 2编码基因的缺失或突变可能是导致外膜蛋白OprD 2缺失或减少的分子基础，并是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素尤其是亚胺培南耐药的主要机制之一。
关键词：铜绿假单胞菌；耐药性；碳青霉烯类抗生素；外膜蛋白中图分类号：R978．11；R378．991文献标志码：A文章编号：1009-7708（2011）04-0281-06基金项目：国家973资助项目（2005CB523101）；国家自然科学基金项目（30772619）。
作者单位：复旦大学附属华山医院抗生素研究所，上海200040。
作者简介：沈继录（1974—），男，博士，主管技师，主要从事细菌耐药性及机制研究。
：：Study on outer membrane protein OprD 2of carbapenem-resistant PseudomonasaeruginosaSHEN Jilu ，ZHU Demei ，WU Weihong ，WANG Minggui．（Institute of Antibiotics ，Huashan Hospital ，Fudan Uni-versity ，Shanghai 200040，China ）Abstract ：Objective To study the relation between outer membrane protein OprD 2and carbapenem resistance in P．aerugino-sa ．Methods Minimal inhibitory concentration （MIC ）of 141strains of P．aeruginosa to imipenem and meropenem was deter-mined by agar dilution method．Outer membrane oprD 2encoding gene was analyzed by PCR and DNA sequencing．Outer mem-brane proteins were extracted from carbapenem-resistant P．aeruginosa and analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE ）．The pattern of outer membrane proteins were compared between the IMP R and IMP S strains．Results Three resist-ant patterns were identified in the 141strains of carbapenem-resistant P．aeruginosa ，including IMP R MEM R （66．7%），IMP R MEM S （32．6%）and IMP R MEM S （0．7%）．DNA sequencing showed various and significant mutations of the oprD 2encoding gene in 136of the 141imipenem resistant strains．Of these strains ，34showed large fragment missing of oprD 2encoding gene ；6with insertion ；96with small fragment missing or multiple point mutations．The oprD 2encoding gene was normal in the 4MBLs-strains and 1imipenem sensitive （meropenem resistant ）strain．The SDS-PAGE profiles of 16carbapenem-resistant P．aerugino-sa showed the loss of membrane protein OprD2at the band of 46000u ，including 10IMP R MEM R strains and 5IMP R MEM Sstrains．The OprD2profile was normal in 1IMP S MEM R strain．Conclusions The loss or mutation of oprD 2encoding gene is the molecular basis of the loss or reduction of outer membrane protein OprD2，which may contribute to the resist-ance of P．aeruginosa to imipenem．Key words ：Pseudomonas aeruginosa ；resistance ；carbap-enem ；outer membrane protein铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是医院感染的主要病原菌之一，常对多种抗菌药物耐药，给临床的感染治疗带来严重威胁，甚至导致治疗失败。
碳青霉烯类抗生素是治疗铜绿假单胞菌感染的重要抗生素。
但随着该类抗生素在临床上的广泛应用，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈快速上升。
文献报道该类耐药性主要是由胞壁屏障机制所致，而由碳青霉烯酶所致的耐药性只占极少部分［1］。
本研究所曾检测141株碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌的碳青霉烯酶，结果显示仅检出4株产VIM-2型金属酶菌株，检出率为3%［2］。
故本研究又对该141株碳青霉烯类抗生素耐药（亚胺培南或美罗培南耐药）铜绿假单胞菌的外膜孔蛋白OprD2进行了研究，现将结果报道如下。
材料与方法一、材料（一）实验菌株收集2005年1—12月我院临床分离的对碳青霉烯类抗生素耐药（亚胺培南或美罗培南抑菌圈≤13mm者）的铜绿假单胞菌141株。
药敏试验质控菌株ATCC27853及十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析OprD2外膜蛋白标准对照菌株PAO1均为本实验室保存菌株。
（二）抗菌药物亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、头孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦均为OXOID公司商品。
亚胺培南为杭州默沙东制药有限公司商品（亚胺培南-西司他汀，效价按亚胺培南量计）。
美罗培南为卫生部中国生物制品药品鉴定所标准品。
（三）培养基与主要生化试剂MH琼脂培养基为OXOID公司商品。
PCR检测试剂Tag酶、Buff-er、dNTP及克隆载体PMD18Vector均为TaKaRa公司商品。
Tris碱、甘氨酸、丙烯酰胺及N，N'-亚甲双丙烯酰胺、N，N，N'N'-四甲基乙二胺（TEMED）、SDS、过硫酸胺（AP）及考马斯亮蓝R250均为上海生物工程公司商品。
PBS液及脱色液自配。
低分子量标准蛋白质（Marker）为上海西巴斯生物技术公司商品。
（四）引物根据GenBank序列（NC_002516）设计引物，并由上海英骏生物技术公司合成。
引物序列OprD-A：ATGAAAGTGATGAAGTGGAGCG，OprD-B：TTACAGGATCGACAGCGGATAG；为1332bp。
（五）生物信息学软件DNAstar软件为美国DNAstar公司产品。
Quality One凝胶成像分析软件为Bio-Rad公司产品。
二、方法（一）药敏试验纸片扩散法按CLSI2005年版［3］推荐K-B法进行。
亚胺培南、美罗培南的MIC 测定按CLSI2005年版推荐的琼脂稀释法进行。
亚胺培南和美罗培南浓度范围为128 0．06mg/L。
细菌接种菌量为1ˑ104CFU/点。
药敏试验结果判断按CLSI2006年版标准。
（二）PCR扩增oprD2编码基因序列分析Yoneyama等［4］报道亚胺培南耐药铜绿假单胞菌oprD常见的缺失突变有2种，一种为编码区395 405位11bp DNA片段小缺失；另一种为启动子上游－519位到编码区685位的1204bp DNA片段大缺失。
本研究设计oprD2全长引物对其编码基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，预期有3种结果：①当菌株染色体oprD2基因无缺失突变或者基因发生11bp的小片段缺失时或发生碱基突变时，均能扩增出相应条带，但是要明确是小片段缺失还是碱基突变还需要进一步测序分析。
②当菌株染色体oprD2基因发生1204bp的大片段缺失时，该引物不能扩增出相应的DNA片段，电泳结果呈阴性。
③当菌株染色体oprD2基因内有插入片段时，该引物也能扩增出相应的DNA片段，电泳结果呈阳性。