第五章 固定化酶讲解
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固定化酶技术ppt课件
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
7
3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
11
3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
第五章 固定化酶和细胞
制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化 固定化酶必须能保持酶原有的专一性 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应能回收 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作 固定化酶应用于机械化和自动化操作， 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体 常有一定的机械强度。 常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即 要保护活性中心基团。 要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近 固定化酶应能最大程度与底物接近， 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 具有最小的空间位阻。 量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性 固定化酶应有最大的稳定性。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离 固定化酶应易与产物分离。 7.固定化酶应易与产物分离。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 1973年 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 天门冬氨酸。 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术 技术。 1976年 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年 日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 固定化原生质体生产谷氨酸 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。 变革提供了新的方向。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
固定化酶
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
固定化
间歇
吸附
包埋
间歇
交联
化学偶联
连续
固定化酶的优缺点
可重复使用
可以装塔连续反应
优点： 纯化简单，易与产物分离
提高产物质量
应用范围广
固定化过程中酶易失活
缺点： 首次投入成本高
大分子底物较困难
二、固定化酶的性质及其影响因素
常用于固定化酶的交联剂 交联剂 戊二醛 二重氮联苯胺－2，2‘－二磺酸 4，4‘－二氟－3，3’－二硝基二苯砜 二苯基－4，4‘－二硫氰酸－2，2’－二磺酸 1，5－二氟－2，4－二硝基苯 酚－2，4－二磺酰氯 3－甲氧基二苯基甲烷－4，4‘－二异氰酸盐
酶共价交联有2种形式： 酶直接交联法 酶辅助蛋白交联
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
辅酶固定化的方法：
固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚 胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当 的化学修饰后固定在超滤器中。
这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性 好。
5、共价偶联法
图 7－11 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
第五章固定化酶和细胞
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
第五章-固定化酶..
理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此空间 进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化酶或细 胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反 应的酶。
2
一、固定化酶发展简史
3
一、固定化酶发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定 化研究，并第一次实现了酶的固定化。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的 空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位 造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应 物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所 造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效 应。
34
三、固定化酶的性质
酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的 话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。
40
三、固定化酶的性质
4、固定化酶的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度 的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提 高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的 结果。
41
三、固定化酶的性质
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力 变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至 消失。
三、固定化酶的性质
（二） 固定化酶性质的改变
1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下 降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因：
2
一、固定化酶发展简史
3
一、固定化酶发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定 化研究，并第一次实现了酶的固定化。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的 空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位 造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应 物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所 造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效 应。
34
三、固定化酶的性质
酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的 话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。
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三、固定化酶的性质
4、固定化酶的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度 的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提 高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的 结果。
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三、固定化酶的性质
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力 变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至 消失。
三、固定化酶的性质
（二） 固定化酶性质的改变
1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下 降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因：
第五章 酶工程制药技术
抗炎净创类：目前在治疗上发展最快。 多数为蛋白水解酶，分解发炎部纤维蛋白的凝结物，
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
酶工程原理及应用-04 05 酶的工程化改造(分子修饰和固定化)
-OH
20K
100
10
mPEGCOOH5
-COOH
5K
100
10
mPEGCOOH10
-COOH
10K
100
10
mPEGCOOH20
-COOH
20K
100
10
MPEG-NHS5
-N-羟基琥珀酰亚 胺
5K
100 10
5
MPEGNHS10
-N-羟基琥珀酰亚 胺
10K
100 10 5
MPEGNHS20
-N-羟基琥珀酰亚 胺
20K
100 10 5
3500 700
7000 1400
7000 1400
10000 2000
15000 3000
20000 4000
20000 4000 2000
30000 6000 3000
35000 7000 3500
IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白
Comassie blue stain Iodine stain
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合 剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成 螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从 酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子， 酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经 过金属离子置换后的酶。
1 2 34 5
45
1
2
3
4+
94.0 66.2 43.0
31.0
-
20.1
《固定化酶》课件
《固定化酶》课件
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
第五章酶的固定化
纯化倍数 Purification
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
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• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、 明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子 化合物
网格型
微囊型
聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶
3）叠氮法
• 对含有羧基的载体，与肼作用生成含有酰肼的载 体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于 酶偶联 。
4．交联法 • 用双功能或• 不使用载体 • 常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双
重氮联苯胺等。
• 酶的反应基团：N末端的α -氨基或赖氨 酸ε -氨基、酚基、 巯基和咪唑基等。
能力。 • 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶
(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μ mol·min-1·mg-1。 • 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的 反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。
二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的 百分数
偶联效率
加入的蛋白量- 溶液中残留的蛋白量 100%
高。
3．对不同pH稳定性、对蛋白酶稳定性、 贮存稳定性和操作稳定性都有提高。
青霉素酰化酶于不同温度下保温6小时
稳定性提高的原因：
① 固定化后酶分子与载体多点连接，可防 止酶分子伸展变形。
② 酶活力的缓慢释放。
③ 抑制蛋白酶的降解, 阻挡了外界不利因 素对酶的侵袭.
（三）固定化酶的最适温度变化 最适温度提高。 （四）固定化酶的最适pH变化 对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发 生偏移。
液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的 高聚物网络。 海藻酸钠：
可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 卡拉胶：
冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。
• 优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收 率较高。
• 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小 分子底物和产物的酶。
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
2．分配效应和扩散限制效应
• 分配效应：是由于固定化载体所带电荷 及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以 及其他效应物在微观环境与宏观体系间 发生了不等分配，改变了酶反应系统的 组成平衡，从而影响酶反应速度的一种 因素。
扩散限制效应：指底物、产物以及其他 效应物的迁移和运转速度受到限制的一 种效应。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定； ③可以在较长时间内进行反复分批反应 和装柱连续反应； ④ 酶反应过程能够加以严格控制； ⑤ 较游离酶更适合于多酶反应。
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
二 、固定化方法
1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化 方法。
• 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、 纤维素、树脂。
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏 和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
原因：微环境表面电荷性质的影响。 • 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，
即向碱性偏移。 • 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 • 载体与底物电荷相同：表观Km值显著
上升；
• 载体与底物电荷相反：Km ？
四、影响固定化酶性能的因素
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、 明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子 化合物
网格型
微囊型
聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶
3）叠氮法
• 对含有羧基的载体，与肼作用生成含有酰肼的载 体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于 酶偶联 。
4．交联法 • 用双功能或• 不使用载体 • 常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双
重氮联苯胺等。
• 酶的反应基团：N末端的α -氨基或赖氨 酸ε -氨基、酚基、 巯基和咪唑基等。
能力。 • 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶
(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μ mol·min-1·mg-1。 • 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的 反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。
二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的 百分数
偶联效率
加入的蛋白量- 溶液中残留的蛋白量 100%
高。
3．对不同pH稳定性、对蛋白酶稳定性、 贮存稳定性和操作稳定性都有提高。
青霉素酰化酶于不同温度下保温6小时
稳定性提高的原因：
① 固定化后酶分子与载体多点连接，可防 止酶分子伸展变形。
② 酶活力的缓慢释放。
③ 抑制蛋白酶的降解, 阻挡了外界不利因 素对酶的侵袭.
（三）固定化酶的最适温度变化 最适温度提高。 （四）固定化酶的最适pH变化 对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发 生偏移。
液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的 高聚物网络。 海藻酸钠：
可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 卡拉胶：
冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。
• 优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收 率较高。
• 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小 分子底物和产物的酶。
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
2．分配效应和扩散限制效应
• 分配效应：是由于固定化载体所带电荷 及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以 及其他效应物在微观环境与宏观体系间 发生了不等分配，改变了酶反应系统的 组成平衡，从而影响酶反应速度的一种 因素。
扩散限制效应：指底物、产物以及其他 效应物的迁移和运转速度受到限制的一 种效应。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定； ③可以在较长时间内进行反复分批反应 和装柱连续反应； ④ 酶反应过程能够加以严格控制； ⑤ 较游离酶更适合于多酶反应。
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
二 、固定化方法
1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化 方法。
• 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、 纤维素、树脂。
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏 和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
原因：微环境表面电荷性质的影响。 • 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，
即向碱性偏移。 • 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 • 载体与底物电荷相同：表观Km值显著
上升；
• 载体与底物电荷相反：Km ？
四、影响固定化酶性能的因素