细胞生物学研究方法

2.细胞生物学研究方法

生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验得以发现和发展的。方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。

2.1显微成像技术

最早的光学显微镜是1590年Z.J a n s s en和他的侄子H.J a n s s e n共同研制的。其后，R o b e r t H o o k e和An t o n i e v a n L e e u we n h o e k对光学显微镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。

20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命，使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞(图2-1)。

图2-1光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构

2.1.1光学和电子显微镜成像原理

不管是何种显微镜，镜像的形成都需要三个基本要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统(图2-2)。

图2-2光学和电子显微镜的基本结构

在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。

照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限。波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到的物体极限就越大(图2-3)。

图2-3波的移动、波长和干扰

●光学和电子显微镜成像的光学原理是相同的，其中最重要的是光子和电子都具有波的行为。当光子和电子穿过透镜到达聚焦点时，由于波的干涉(i n t e r fe r e n c e)性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是通过透镜波的干涉累加或消除，即衍射(d i ffr a c t i o n)的结果。

●焦距与角孔径

焦距(fo c a l l e n g t h)是透镜的中心平面到焦点的距离(图2-4)，而角孔径(a n g u l a r a p e r t u r e)是光从样品进入显微镜的物镜半角α(图2-5)，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是700。

图2-4透镜的焦距

图2-5透镜的角孔径

角孔径是光从样品进入透镜的半角α。(a)小孔径透镜;(b)大角孔径透镜。角孔径越大，透过透镜的信息越多，最好的玻璃透镜的角孔径大约是700

■分辨率(r e s o l u t i o n)

透镜最重要的性质就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式计算:

R=0.61λ/n S i nα

其中:n=聚光镜和物镜之间介质的折射率.空气为 1.油为 1.5;

α=样品对物镜角孔径的半角，s i nα的最大值为1;

λ=照明光源的波长。

0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度。

上式中n S i nα的量称为物镜的数值孔径(n u me r i c a p e r t u r e)，缩写为N A，因此显微镜的分辨率的表示公式可改为:R=0.61λ/N A

从上式可知，角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以使分辨率提高。

由于分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力，所以R值越小，分辨率越高。从分辨率的表达式来看，N A越大，分辨率越高，或者波长越短，分

辨率越高。

■分辨极限(l i mi t r e s o l u t i o n)与放大率(ma g n i f i c a t i o n)

●一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2μm，称之为分辨极限(l i mi t r e s o l u t i o n)。

●最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。总放大率=物镜放大率×目镜放大率，放大率同样受分辨极限的限制。一般来说，光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍。由于透镜的数值孔径的范围是 1.0～1.4，所以光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍，用油镜则为1400倍。

●增大角孔径或缩短波长可提高光学显微镜的分辨率。如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波，分辨率可大大提高，电子显微镜就是在这种需求下被发明的。表2-1是光学显微镜与电子显微镜某些特性的比较。

表2-2电子显微镜与光学显微镜的基本区别

2.1.2常用的光学显微镜

光学显微镜(l i g h t mi c r o s c o p e)是光学显微技术的主要工具，自问世以来已有400多年历史。光学显微镜是利用光线照明，使微小物体形成放大影像的仪器。现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成，所以又称为复合显微镜

(c o mp o u n d mi c r o s c o p e)(图2-6)。

图2-6普通光学显微镜的基本结构

■普通双筒显微镜(b i n o c u l a r mi c r o s c o p e)

比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒(图2-7)。在物镜转换器上方装有四个棱镜，使经过物镜的光线平分为两路到达目镜，故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗。双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。

图2-7双筒显微镜

■荧光显微镜(f l u o r e s c e n c e mi c r o s c o p e)

荧光显微镜的工作原理是利用紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)发出强烈的紫外线光源，通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来，基本成像原理示于图2-8。

图2-8荧光显微镜的光通路

■相差显微镜(p h a s e c o n t r a s t mi c r o s c o p e)

相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的不同(图2-9)，可用于观察未染色的活细胞(图2-10)。