分子标记连锁图的构建_两点自交法
分子标记遗传图谱的构建方法---完整讲义
分子标记遗传图谱的构建检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。
为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。
利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。
其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。
至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。
本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。
第一节作图群体的建立要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。
建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。
一、亲本的选配亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。
一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。
亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。
一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。
例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学S.D.Tanksley实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。
在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA多态性非常丰富。
第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。
第三，要考虑杂交后代的可育性。
亲本间的差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。
第3章 分子图谱的构建总结
干扰的程度用符合系数C表示。
C=实际双交换值/理论双交换值
要计算两个相距较远的基因座之间的图距时，如 果中间没有其他基因座可用，则两个基因座之间实际 发生的双交换就不能被鉴定出来。而由于双交换的结
果，会使根据重组值估计的两个基因座位间的距离估
计值偏低。因此，采用一些数学的方法矫正。
Haldane作图函数 :
Dist cM
1
Mar ker Id Name (71) RG472 RG246 K5 U10 RG532 W1 RG173 Amy1B RZ276 RG146 RG345 RG381 RZ19 RG690 RZ730
Dist cM
1-轮回亲本的纯合基因型（aa）
2-杂合体（ab） 3-非轮回亲本的纯合基因型（bb） 0-缺资料
群体的特点:
优点：
群体容易产生；
直接反映了F1代配子的分离比例，作图效率高； 适合亲缘关系较远的亲本；
缺点：
非永久性群体；
当显性时表现型和基因型鉴定都有麻烦；
对人工杂交困难的植物，不易建立大的群体，且易 出现假杂种。
的重组率。
3、图谱制作的统计学原理
（1）两点测验：对两个基因座之间的连锁关系
进行检测。
▲χ2检测标记座位是否符合孟得尔分离比例，严重异常 分离的标记一般不能用于连锁作图； ▲ 重组率是根据分离群体中重组型个体占个体总数的比 率来估算的。这种估算方法无法得到估算值的标准误，因此 无法对估算进行显著性检验。采用最大似然法估计 （maximum likelihood estimation，MLE）方法进行重组率
△排序（sequence）：
通过多点分析，可以计算出在同一连锁群内不同排列 顺序下，各座位之间的距离和连锁群的总长度。
实验三 分子标记连锁图的构建
遗传标记
有可以识别的标记， 有可以识别的标记，才能确定目标的方位 及彼此之间的相对位置。 及彼此之间的相对位置。 构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上 的特征标记。 的特征标记。 包括： 包括： 形态标记 细胞学标记 生化标记 DNA分子标记 DNA分子标记
多态性（ 多态性（polymophism） ）
所有的标记都必须具有 多态性！ 多态性
花色：白色、 花色：白色、红色 株高：高、矮 株高： 淀粉： 淀粉：糯、非糯
形态标记
形态性状：株高、颜色、 形态性状：株高、颜色、白化症等 又称表型标记 数量少 很多突变是致死的 受环境、 受环境、生育期等因素的影响
最早建立的果蝇连锁图， 最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制 果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、 果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、 翅膀的形状等形态性状作为标记， 翅膀的形状等形态性状作为标记，分析 它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。 它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。 控制性状的其实是基因， 控制性状的其实是基因，所以形态标记 实质上就是基因标记。 实质上就是基因标记。
总数
6708
交换值的计算
sh-wx sh-c
+ wx c sh + + + + c
2708 2538 626 601 113 116 4 2 6708
｝亲 型
｝单交换
18.29%
sh wx + sh + c + wx + + + +
｝单交换
3.41%
｝ 双交换
0.09%
0.09%
sh wx c 总数 交换值
18.38%
3.50%
烟草基因组计划进展篇：3.烟草分子标记遗传连锁图构建和重要抗病基因定位
内外相关单位 ， 开展 了烟草分子标记开发、 遗传连锁 图构建和抗病基因定位等研究工作 ， 取得 了重要进展 。
１ 构建 了第一张烤烟 Ｓ Ｓ Ｒ标记遗传连锁 图
个Ｆ ２ 单株进行 Ｓ Ｓ Ｒ标记分析 ，经遗传作图，构建出含 ８ ４ ３ 个标记 、由 ｌ ２ 个连锁群组成的野生烟草遗传 图
谱 ，覆 盖全基 因组 长度 为 １ ４ ３ ４ ． ６ ８ ｃ Ｍ Ｊ 。
３ 精 确 定 位 了抗 黑 胫 病 基 因 Ｐ ｈ
以感 黑胫 病 品种红 花大 金元 、 抗 黑胫 病种 质 Ｒ ＢＳ Ｔ和 Ｆ １ 为材料 ， 从 １ ０ ０ ０ ５对 烟草 Ｓ Ｓ Ｒ引 物筛选 出 ６ ０ ３ 对 多态 性引 物 ，经 Ｂ Ｃ１（ 红花 大金 元／ Ｒ ＢＳ Ｔ ／ ／ ￣花 大金元 ）群体 ２ １ ３个单 株 的 Ｓ Ｓ Ｒ标 记分 析 ，获得 ６ ０ １ 个
ｌ １ ８
中国烟草科学
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｃ 基 因组 计 划 进展 篇 ：
３ ． 烟草分子标记遗传连锁 图构建和重要抗病基 因定位
肖炳 光
（ 云南 省烟草农业科学研究 院，昆 明 ６ ５ ０ ０ ３ １ ）
子标记遗传连锁图 ， 覆盖全基 因组长度 为 ２ ６ ０ ２ ． ６ ６ ｃ Ｍ。为确保黑胫病抗性鉴定 的准确性和可靠性 ， 取Ｂ Ｃ １
各单株叶片进行组织培养 ， 利用株系抗性鉴定结果代替单株抗性鉴定结果。结合分子标记分析和抗性鉴定
数据 ，将抗黑胫病基因 Ｐ ｈ 定位在标记 Ｐ Ｔ ５ ２ ６ ３ ４和 Ｐ Ｔ ５ ２ ８ ０ ０ 之间约 ｌ Ｏ ． ６ ６ ｃ Ｍ 范围内【 ９ 】 。 在上述定位的基础上 ，将引物 Ｐ Ｔ ５ ２ ６ ３ ４和 Ｐ Ｔ ５ ２ ８ ０ ０的 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物在中国烟草基 因组数据库中进行 比对 ，利用相应 Ｓ ｃ ａ ｆ ｏ ｌ ｄ的基 因组序列数据新开发了 １ ０ ３ 对Ｓ Ｓ Ｒ引物。从中筛选 出 １ ０ 对多态性引物 ，经 ２ １ ３ 个Ｂ Ｃ １ 单株的基因型分型分析 ，鉴定出与 目 标基因连锁最紧密的两侧各 ２ 个Ｓ Ｓ Ｒ标记 ，再进行 ２ ４ ６ ３ 个Ｂ Ｃ １ 单株 的基 因型分型分析。结合 ２ ４ ６ ３ 个Ｂ Ｃ １ 单株基因型数据和 １ ２ ７ ３ 个Ｂ Ｃ １ 单株抗性鉴定数据，将 抗 黑胫病基因 Ｐ ｈ 精确定位在标记 Ｔ Ｍ１ ０ ４ ０ １ 和Ｐ Ｔ ５ ２ ６ ３ ４问的 ０ ． １ ９ １ ｃ Ｍ 范围内 ，为定位克隆和分子标记辅
我国蔬菜作物基因组研究与分子育种
中国农业科技导报,2010,12(2):24-27Journal of Agricultural Science and Technol ogy 收稿日期:2010201215;修回日期:2010203210 基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD01A07)资助。
作者简介:杜永臣,研究员,博士,博士生导师,主要从事番茄遗传育种和抗逆生物学研究。
E 2mail:yongchen .du@mail .caas .net .cn 编者注:本文为首届中国(博鳌)农业科技创新论坛大会报告,经作者整理而成。
我国蔬菜作物基因组研究与分子育种杜永臣, 王晓武, 黄三文(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)摘 要:我国是世界蔬菜生产大国,也是蔬菜种子销量大国,蔬菜的育种与推广非常重要。
分析了我国蔬菜育种的优势和面临的挑战,综述了蔬菜基因组学和分子育种方面的研究进展,对“十二五”期间蔬菜研究的发展进行了展望。
关键词:蔬菜;基因组学;分子育种do i:10.3969/j .issn .100820864.2010.02.05中图分类号:S63.603.6 文献标识码:A 文章编号:100820864(2010)022*******Veget able Crops Genom i cs Research and M olecul arBreed i n g i n Ch i n aDU Yong 2chen,WANG Xiao 2wu,HUANG San 2wen(I nstitute of Vegetables and Fl owers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China )Abstract:China is the largest vegetable p r oducing country in the world and als o has big vegetable seed sales volu me .Vegetable cr op s breeding and p r omoti on are very i m portant .This paper analyzes the advantages of vegetable cr op s breeding in China and the challenges facing us;expounds the research p r ogressmade in vegetable cr op s genom ics and molecular breeding;p r os pects the devel opment of vegetables research during the t w elfth “Five Years Plan ”peri od .Key words:vegetable;genom ics;molecular breeding 我国是世界蔬菜生产大国,2009年全国蔬菜生产播种面积比2008年略有增加,达到1820亿h m 2,增加1.8%,总产量约6亿t 。
数量性状的分子标记（QTL定位的原理和方法讲义）
数量性状的分⼦标记（QTL定位的原理和⽅法讲义）数量性状的分⼦标记(QTL定位的原理和⽅法讲义)作物中⼤多数重要的农艺性状和经济性状如产量、品质、⽣育期、抗逆性等都是数量性状。
与质量性状不同，数量性状受多基因控制，遗传基础复杂，且易受环境影响，表现为连续变异，表现型与基因型之间没有明确的对应关系。
因此，对数量性状的遗传研究⼗分困难。
长期以来，只能借助于数理统计的⼿段，将控制数量性状的多基因系统作为⼀个整体来研究，⽤平均值和⽅差来反映数量性状的遗传特征，⽆法了解单个基因的位置和效应。
这种状况制约了⼈们在育种中对数量性状的遗传操纵能⼒。
分⼦标记技术的出现，为深⼊研究数量性状的遗传基础提供了可能。
控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。
利⽤分⼦标记进⾏遗传连锁分析，可以检测出QTL，即QTL定位（QTL mapping）。
借助与QTL连锁的分⼦标记，就能够在育种中对有关的QTL的遗传动态进⾏跟踪，从⽽⼤⼤增强⼈们对数量性状的遗传操纵能⼒，提⾼育种中对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。
因此，QTL定位是⼀项⼗分重要的基础研究⼯作。
1988年，Paterson等发表了第⼀篇应⽤RFLP连锁图在番茄中定位QTL的论⽂。
之后，随着分⼦标记技术的不断发展以及许多物种中分⼦连锁图谱的相继建成，全世界出现了研究QTL的热潮，每年发表有关QTL 研究的论⽂数量⼏乎呈指数增长（图5.1），显⽰了该研究领域的勃勃⽣机。
⽬前，QTL定位研究已在许多重要作物中展开，并且进展迅速。
本章主要介绍QTL定位的原理和⽅法。
图5.11986~1998年期间国际上每年发表有关QTL研究的论⽂的数量. 数据从英国BIDS信息系统检索得到第⼀节数量性状基因的初级定位QTL定位就是检测分⼦标记（下⾯将简称为标记）与QTL间的连锁关系，同时还可估计QTL的效应。
QTL定位研究常⽤的群体有F2、BC、RI和DH。
这些群体可称为初级群体（primary population）。
分子标记技术
CAPACITY
RFLPs
HiSpeed sequ
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP SSRsAFLPs RAPDs
1985
1990
1995
2000
2 分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。
2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
都有害； ✓ 探针的制备、保存和发放也很不方便； ✓ 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA
转录组测序方法简介
转录组测序方法简介2004级博士生朱江转录组广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合；狭义上指所有mRNA的集合。
蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述。
基因组－转录组－蛋白质组是中心法则（DNA-mRNA-Protein）在组学框架下的研究模式。
限于目前蛋白质实验技术的限制，转录组成为研究基因表达的主要手段。
通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来刻画基因表达水平并外推到最终蛋白产物的丰度是目前基因表达研究的基本思想。
研究转录组的基本方法包括基于杂交的芯片技术和转录组测序方法。
通过转录组测序研究基因表达的理论基础是：通过随机抽样测序，某一转录本的抽样频率在大样本下逼近该转录本在转录组中的相对丰度。
转录组抽样测序不限于预先确定的基因集，可以检测未发现的转录本和可变剪接体，芯片杂交只能研究芯片上既定的基因和转录本。
另外，除去cDNA转化过程中的实验误差两种方法同时存在外，转录组测序方法只涉及到抽样的随机误差，这类噪音可以通过统计分析滤除，而芯片分析在从杂交到荧光扫描的每一步均存在很难进行统计描述的噪音。
随着并行测序技术的发展，测序成本降低，大规模转录组测序将成为转录组研究的重要方法。
转录组测序主要包括EST, SAGE,CAGE, MPSS, PET和全长cDNA测序（表一）。
1991年Adams开创了EST测序，对每个转录本测定400bp-500bp 的标签序列，每个cDNA文库测定数万个EST以刻画所研究的转录组。
至今，EST 数据成为数量最多，涉及物种最广的转录组数据。
NCBI设立了专门的数据库dbEST来存放这些剧烈增长的数据。
由于EST数据仅代表转录本 400bp-500bp的片段，并且只经过single-pass测序，序列质量较低，对于精确刻画基因结构存在很多局限。
1995年Velculescu建立了SAGE测序方法，利用转录本3端第一个CATG位点下游14p长的短标签来标识相应转录本。
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｝亲 型
｝单交换
18.29%
sh wx +
sh + c + wx +
601
113 116 ｝单交换
3.41%
+ +
+
4
2 6708
｝双交换
0.09%
0.09%
sh wx c 总数 交换值
18.38%
3.50%
连锁遗传图
c Sh Wx ━┿━━━━┿━━━━━━━━━━━┿━ 3.50 18.38
Wx-c之间的距离为：18.38 + 3.50 = 21.88
表型 个体数目 ec ct + 2125 + + cv 2207 ec + cv 273 + ct + 265 ec + + 217 + ct cv 223 + + + 5 ec ct cv 3 合计 5318
比例 81.5% 10.1% 8.3% 0.1% 100%
类型 亲本型 单交换型 单交换型 双交换型
↓ +wxc sh++ ++c shwx+ sh+ c + wx+ +++ shwxc 总数 ↓ shwxc 2708 ｝亲 型 2538 626 ｝单交换 601 113 ｝单交换 116 4 ｝双交换 2 6708
交换值的计算
sh-wx sh-c
+ wx c sh + + + + c
Hale Waihona Puke 2708 2538 626
3 实验材料
P1：中花11 X 浙辐802：P2 F1 F2：94个个体
4 实验方法
第1步：P1和P2间的多态性标记筛选，得到RM234（93.9）、
RM248（118.0） 第2步：对F2群体的94个个体分别检测RM234、RM248位 点的基因型（见电泳图） 第3步： 读出94个个体分别在RM234、RM248位点的基因 型
RM234
P1 2
P2
1 3
RM248
P1 2
P2
1 3
作业
• 计算RM234与RM248之间的交换值。
实验3 分子标记连锁图谱的构建
果 蝇 连 锁 图
1 实验目的
掌握分子标记连锁图谱构建的基本原理 掌握两点自交法的数据统计处理及分析方法
2 实验原理
三点测交法
P 凹陷 非糯 有色 × 饱满 糯性 无色 shsh++++ ↓ ++wxwxcc Ｆ1 饱满 非糯 有色 × 凹陷 糯性 无色 +sh+wx+c shshwxwxcc